廖春暉， 李明飛， 葉金梅， 彭偉， 陳松齡

1.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔正畸科，廣東 廣州（510000）； 2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，廣東 廣州（510080）

上頜后牙區(qū)骨量不足牙種植目前仍是種植領(lǐng)域的難題［1］。上頜竇底提升術(shù)是解決上頜后牙種植區(qū)骨量不足的常用的方法，其核心機制是竇底提升術(shù)后的空間成骨效應(yīng)［2］。上頜竇黏膜在竇底提升術(shù)后不僅起到天然的生物屏障作用，同時因其本身具有成骨潛能的干細胞，在上頜竇底提升術(shù)后空間成骨扮演著重要的作用［3］?，F(xiàn)有的研究多關(guān)注于上頜竇黏膜干細胞（maxillary sinus membrane stem cells，MSMSCs）的成骨能力，而對其核心的分子調(diào)控機制的研究甚少。為明確胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor1，IGF1）參與調(diào)控MSMSCs 成骨分化的分子調(diào)控機制，本研究擬將構(gòu)建的IGF1 基因表達重組腺病毒Ad-IGF1 感染上頜竇黏膜干細胞，通過Western blot、免疫組化染色觀察在上頜竇黏膜干細胞分化過程中，BMPSmads 通路中重要信號蛋白骨形態(tài)形成蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP2）和Smad1/5 的磷酸化水平以及核轉(zhuǎn)位變化情況；利用BMPSmads 通路抑制劑Noggin 和p38MAPK 的通路抑制劑SB203580 處理感染Ad-IGF1 的細胞，觀察成骨標(biāo)志物的表達變化；并觀察抑制劑處理感染Ad-IGF1 的細胞后磷酸化Smad1 蛋白表達變化情況。本研究獲得中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

Beagle 犬（高要市康達實驗動物科技有限公司），年齡1～2 周歲，體重15～20 kg。胎牛血清（Gibco，美國）；中性蛋白酶（Roche，美國）；Ⅱ型膠原酶（Gibco，美國）；α-MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（武漢市博士德公司）；CD146 磁珠分選試劑盒（Macs，美國）；LipofectamineTM2000（Invitrogen，美 國）；Trizol Reagent（Invitrogen，美國）；DAB 試劑盒（Abcam，英國）；熒光定量PCR 檢測試劑盒（Takara，日本）；兔抗犬Runx2、OPN、p-p38、p-Smad1/5、Smad1/5、BMP2多克隆抗體（Abcam，英國）；羊抗兔IgG-HRP（Abcam，英國）；圖像Pro 5.0 分析系統(tǒng)（Media Cybernetics，美國）；茜素紅（Thermo Fisher Scientific，美國）。

1.2 犬上頜竇黏膜干細胞的分離與培養(yǎng)

Beagle 犬上頜竇黏膜的取材按本課題組前期報道的方法去采集［3］。使用酶消化法進行細胞的原代培養(yǎng)，培養(yǎng)至70%～80%匯合時傳代，按照1∶3 的比例進行傳代擴增培養(yǎng)。按照CD146 磁珠分選試劑盒操作方法進行免疫磁珠法分選CD146 陽性細胞，簡述如下：單細胞懸液中按4 μL/mL 加入小鼠抗犬CD146 免疫磁珠，混合均勻后置于4 ℃孵育30 min，PBS 潤洗2 次，避免干燥。準(zhǔn)備磁力架和磁柱，PBS 潤洗2 次，把結(jié)合了磁珠的細胞懸液放入磁柱中，過柱，PBS 清洗混勻。并取樣品滴于載玻片和細胞計數(shù)器上，分別進行細胞純度分析和活力測定。用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況及細胞形態(tài)。

1.3 IGF1 基因表達重組腺病毒Ad-IGF1 載體構(gòu)建

根據(jù)IGF1 基因序列，設(shè)計末端帶NheI 和HindⅢ的酶切位點的特異性引物，將通過PCR 擴增的IGF1 基因序列克隆到PDC316-mCMV-ZsGreen 載體中，構(gòu)建PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 腺病毒載體（圖1），即Ad-IGF1 載體。IGF1 引物擴增總長度為462 bp，引物序列設(shè)計如下。IGF1-NheI-F：5′-CTAGCTAGCACCATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCC-3′；IGF1-HindⅢ-R：5′-CCAAGCTTCTACATTCTGTAGTTCTTGTTTCCTG-3′。

Figure 1 Map of PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 vector圖1 PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 腺病毒載體示意圖

1.3.1 PCR 擴增目的基因 PCR 擴增IGF1，在引物中引入NheI+ HindⅢ酶切位點，按以下組分制備PCR 反應(yīng)體系：5 × Fastpfu buffer 10 μL，dNTP Mix（2.5 mM）4 μL，正向引物（10 μM）2 μL，反向引物（10 μM）2 μL，F(xiàn)astpfu polymerase 1 μL，模板DNA（100 ng/μL）1 μL，ddH2O 30 μL，Total 50 μL。按以下條件設(shè)置反應(yīng)程序進行PCR 反應(yīng)：變性95 ℃×3 min 1 個循環(huán)，變性95 ℃，退火55 ℃× 30 s 30 個循環(huán)，延伸72 ℃× 2 min，延伸72 ℃× 5 min 1 個循環(huán)。瓊脂糖凝膠回收目的條帶進行分析。

1.3.2 載體質(zhì)粒PDC316-mCMV-ZsGreen 及目的基因NheI+HindⅢ雙酶切 酶切反應(yīng)在37 ℃水浴反應(yīng)2 h，載體質(zhì)粒酶切體系如下：質(zhì)粒PDC316-mCMVZsGreen/IGF1 1 μg，10×Buffer 2 μL，10×BSA 2 μL，NheI 1 μL，HindⅢ1 μL。分別回收質(zhì)粒PDC316-mCMV-ZsGreen酶切大片段和目的基因酶切產(chǎn)物。

1.3.3 質(zhì)粒PDC316-mCMV-ZsGreenNheI+ HindⅢ回收大片段與目的基因連接 連接反應(yīng)在22 ℃反應(yīng)2 h，連接反應(yīng)體系如下：目的基因6 μL，PDC316-mCMV-ZsGreen 2 μL，10 × DNA Ligase Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL。

1.3.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 取10 μL 上述連接產(chǎn)物和100 μL JM109 感受態(tài)細菌混合均勻后冰浴30 min，在42 ℃下熱激45 s，立即放置冰上2 min，放入預(yù)熱至室溫的400 μL 的LB 培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)1 h 后，4 000 rpm 離心1 min，棄400 μL 上清夜，用移液器混勻剩余100 μL 后均勻涂布在含100 μg/mL Ampicillin 抗性LB 板上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。

1.3.5 重組質(zhì)粒提取、挑選鑒定及病毒包裝 選取4 個單菌落接種于含有100 ug/mL Ampicillin 抗性的5 mL LB 培養(yǎng)液中，250 rpm，在37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜，使用小量質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒NheI+ HindⅡ雙酶切鑒定，克隆并切出462 bp 條帶。測序驗證鑒定正確的重組克隆。測序引物為：

CMV-F（CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG）。PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 與PDC316-mCMV-ZsGreen 腺病毒病毒包裝。用攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒PDC316-mCMV-ZsGreen、PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293 細胞，獲得攜有目的基因的腺病毒，然后通過擴增技術(shù)獲得高滴度的病毒，標(biāo)記為AD-IGF1，對照病毒為僅攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的AD-GFP。

1.3.6 基因表達重組腺病毒Ad-IGF1 感染效率檢測 取對數(shù)生長期P3 代MSMSCs，以2.5×105個/瓶接種于到T25 培養(yǎng)瓶中，分為IGF1 感染組（Ad-IGF1）和陰性對照組（Ad-GFP），僅攜帶GFP 的空載體腺病毒Ad-GFP 作為陰性對照組。在37 ℃，5%CO2α-MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，將IGF1 基因表達重組腺病毒Ad-IGF1 按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為50～200 感 染 細胞，感染細胞后更換α-MEM 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。每組重復(fù)3瓶。24 h后對感染Ad-IGF1和Ad-GFP 的細胞進行顯微鏡拍照。收集實驗組和對照組的細胞，用于qRT-PCR 檢測。

1.4 Noggin 或 者SB203580 處 理 感 染Ad-IGF1 的細胞

取感染Ad-IGF1 的P3 代MSMSCs 以1 × 105個/孔接種于6 孔板中，分為Noggin 處理組（Ad-IGF1+Noggin），單純Ad-IGF1 感染的對照組（Ad-IGF1）以及Ad-IGF1 感染合并α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的空白對照組（Ad-IGF1+ medium）。采用BMP-Smad 依賴特異性抑制劑Noggin，進行功能實驗探索IGF1 在MSMSCs 成骨中作用機制。具體細胞處理步驟如下：感染Ad-IGF1 的P3 代MSMSCs 以1 × 105個/孔接種于6 孔板中，37 ℃，5%CO2α-MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細胞貼壁后100 g/mL BMP-Smads 信號通路抑制劑Noggin 或者等體積的α-MEM 培養(yǎng)基預(yù)處理細胞1 h，之后更換α-MEM 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，單純感染Ad-IGF1 細胞在α-MEM 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，并作為對照組，每組重復(fù)3 孔。

同上，p38MAPK 特異性抑制劑SB203580 處理及分組和Noggin 處理一致，其預(yù)處理濃度為20 uM，分組為單純Ad-IGF1 感染的對照組（Ad-IGF1）以及SB203580 處理組（Ad-IGF1+SB203580）。

1.5 茜素紅染色

為了明確不同實驗組（Ad-IGF1、Ad-IGF1+Noggin、Ad-IGF1+ medium）的MSMSCs 鈣鹽沉積情況，使用茜素紅染色進行分析。具體步驟如下：4%的多聚甲醛固定30 min，PBS 漂洗3 次，每次5 min，0.1%的茜素紅（pH 7.2）染色10 min，PBS 漂洗后拍照。

1.6 免疫組化染色

細胞爬片收集后，經(jīng)過固定，透膜和抗原修復(fù)后，加入1∶400 的p-Smad1/5 抗體，4 ℃下孵育過夜，1∶500 羊抗兔IgG-HRP 耦聯(lián)一抗，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，拍照并分析。

1.7 qRT-PCR

Trizol 收集各個時間點各組細胞的RNA，經(jīng)過萃取，酒精清洗后得到干凈的RNA，Nanodrop 測定濃度后，逆轉(zhuǎn)錄1 000 ng/樣本為cDNA，按照表1 設(shè)計引物，其中GAPDH 為內(nèi)參，定量檢測IGF1，Runx2、ALP 和OPN mRNA 表達量。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of the qRT-PCR primers

1.8 Western blot 檢測

RIPA 收集細胞蛋白，BCA 法測量濃度后，取20 μg 蛋白進行定量，電泳分離不同大小蛋白，使用PVDF 膜進行蛋白轉(zhuǎn)膜，裁剪不同分子量大小的膜，經(jīng)過封閉，清洗后，孵育一抗（BMP2、Smad1/5、p-Smad1/5、RUNX2、OPN、p-p38）過夜；次日進行清洗，HRP 顯影，定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，采用獨立樣本t檢驗來比較兩組差異，采用單因素方差分析比較三組及以上差異。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IGF1 基因表達重組腺病毒構(gòu)建及感染效率

在AD-IGF1 和AD-GFP 包裝第1 天，通過熒光顯微鏡觀察HEK293 細胞內(nèi)可見綠色熒光，呈滿天星狀分布，包裝第9 天，呈彗星狀分布，說明IGF1和GFP 基因表達腺病毒包裝過程順利（圖2a）。同時經(jīng)凝膠電泳檢測示質(zhì)粒酶切后的兩個產(chǎn)物均為陽性克隆，產(chǎn)物大小為462 bp 的IGF1 目的基因條帶（圖2b）。MSMSCs 感染攜帶有綠色熒光蛋白的AD-IGF1 和AD-GFP 后，免疫熒光檢測細胞形態(tài)沒有明顯改變，仍然呈多角形或長梭形，細胞質(zhì)中可見綠色熒光信號（圖2c、2d）。MSMSCs 細胞感染Ad-IGF1 培養(yǎng)24 h 后IGF1 mRNA 表達量明顯升高，較感染AD-GFP 組升高了5 倍，兩組間表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2e）。

2.2 MSMSCs 的IGF1 上調(diào)促進磷 酸 化Smad1/5 核轉(zhuǎn)位，并呈時間和劑量依賴性正向調(diào)控BMP2 及磷酸化Smad1/5 的表達

通過免疫組化結(jié)果顯示，感染Ad-IGF1 的MSMSCs 高表達磷酸化Smad1/5，表達部位主要位于胞核，部分胞漿亦可見表達；感染Ad-GFP 細胞的胞核和胞漿不表達或低表達磷酸化Smad1/5，空白對照不表達（圖3a～3c）。進一步通過使用不同濃度的Ad-IGF1（MOI 50-100、150-200、250-300）作用于MSMSCs。細胞成骨誘導(dǎo)3 d 后，基于免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，與Ad-GFP 陰性對照組相比，BMP2 蛋白表達逐漸增強，且隨著Ad-IGF1 滴度增加呈梯度上升，各實驗組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3d）。Smad1/5 總蛋白量無變化，而Smad1/5磷酸化（p-Smad1/5）水平增高，且隨著Ad-IGF1 滴度增加呈梯度上升，各實驗組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3e）。同時觀察了不同時間點（3 h、6 h、12 h、24 h、48 h）的BMP2 和p-Smad1/5 的動態(tài)變化。與0 h 組相比，BMP2 蛋白水平呈時間依賴性增強趨勢，在24 h 時達到高峰，48 h 后表達開始輕微減弱，但48 h 組仍高于0 h 組（圖3f）。Smad1/5 總蛋白量無變化，Smadl/5 的磷酸化水平在12 h 時達到高峰，24 h 后表達輕微減弱，但24 h 和48 h 組仍高于0 h 組（圖3g）。

2.3 IGF1 依賴BMP-Smad 信號通路而非p38MAPK信號通路調(diào)控MSMSCs 的成骨分化

為了進一步探索IGF1 介導(dǎo)MSMSCs 的成骨分化的內(nèi)在核心機制，首先使用BMP-Smads 信號通路抑制劑Noggin 處理Ad-IGF1 感染的MSMSCs，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，發(fā)現(xiàn)磷酸化Smad1/5 水平降低明顯，與單純感染Ad-IGF1 的對照組相比，兩組間表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4a）。并且成骨相關(guān)的標(biāo)志物Runx2、OPN 和ALP mRNA 表達量降低明顯，與對照組相比，各組間mRNA 表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4b）。更重要的是，茜素紅染色結(jié)果表明單純感染Ad-IGF1 的細胞α-MEM 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 d 后，有大量染為紅色的礦化結(jié)節(jié)形成；Noggin 處理Ad-IGF1 感染的MSMSCs 后，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d 也有礦化結(jié)節(jié)形成，但礦化結(jié)節(jié)明顯 減少；Medium 處 理Ad-IGF1 感 染的MSMSCs 后（空白對照），其礦化結(jié)節(jié)量和單純感染Ad-IGF1 類似（圖4c～4e）。然后驗證BMP-非Smads 信號通路在IGF1 調(diào)控MSMSCs 成骨的作用。采用p38MAPK信號通路抑制劑SB203580 處理Ad-IGF1 感染的MSMSCs 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d 后，p38 磷酸化水平與單純感染Ad-IGF1 的對照組相比，兩組間表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4f）。并且成骨相關(guān)的標(biāo)志物Runx2、OPN 和ALP mRNA 表達量與單純感染Ad-IGF1 的對照組相比變化不明顯（圖4g）。這結(jié)果提示IGF1 主要通過BMP-Smads 信號通路調(diào)控MSMSCs成骨分化效應(yīng)。

Figure 2 Restriction of the AD-IGF1 gene and its infection efficiency圖2 IGF1 基因表達重組腺病毒構(gòu)建及感染效率

Figure 3 Upregulation of IGF1 promotes p-Smad1/5 protein nuclear translocation and positively regulates BMP2 and p-Smad1/5 protein expression in MSMSCs in a time-and dose-dependent manner圖3 MSMSCs 中IGF1 上調(diào)促進p-Smad1/5 核轉(zhuǎn)位，并呈時間和劑量依賴性正向調(diào)控BMP2 及p-Smad1/5 的表達

Figure 4 IGF1 depends on the BMP-Smad but not the p38MAPK signaling pathway to regulate MSMSCs osteogenic differentiation圖4 IGF1 依賴BMP-Smad 信號通路而非p38MAPK 信號通路調(diào)控MSMSCs 的成骨分化

3 討 論

上頜竇黏膜干細胞是一類具有成骨潛能的上頜竇黏膜來源的細胞，在上頜竇底提升術(shù)后空間成骨及維持黏膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)中扮演重要作用［4］。IGF1是一種具有內(nèi)分泌和旁分泌特性的多功能肽，通過與細胞表面的IGF1 受體結(jié)合來激活受體的酪氨酸激酶活性，然后使受體-配體復(fù)合物發(fā)生內(nèi)化并激活信號反應(yīng)來調(diào)節(jié)細胞生長、分化和細胞外基質(zhì)中多種因子的表達［5-6］。課題組在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)IGF1 上調(diào)可以促進上頜竇黏膜干細胞的堿性磷酸酶、RUNX2 和OPN 的表達，正向參與上頜竇黏膜干細胞的成骨分化效應(yīng)，然而IGF1 內(nèi)在的成骨調(diào)控通路未進行深入探討［7］。在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化過程中，有研究表明BMP2 刺激細胞成骨分化的功能需依賴于IGF1 激活相關(guān)信號通路如PI3K/AKT 或MAPK 信號通路［8］。而BMP2 為骨基質(zhì)中存在的重要骨生長因子，可通過與細胞膜上I 型和Ⅱ型受體結(jié)合，激活下游信號蛋白Smad1 或Smad5 蛋白質(zhì)羧基末端，從而磷酸化Smad1/5，磷酸化的Smad1/5 與Smad4 結(jié)合，形成復(fù)合物后由胞漿進行核轉(zhuǎn)位，在核內(nèi)蓄積后直接作用于下游的靶基因，或與其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子一起調(diào)控下游靶基因［9-10］。因此課題組推測IGF1 是否可以在細胞成骨分化過程中激活BMP-Smads 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控上頜竇黏膜干細胞的成骨效應(yīng)。

為了揭示IGF1 和BMP2-Smads 的關(guān)系，本研究采用PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 載體構(gòu)建重組腺病毒Ad-IGF1，經(jīng)測序證明載體所連序列正確。然后以不同滴度的Ad-IGF1（50-100、150-200、250-300）作用于上頜竇黏膜干細胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，通過Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，BMP2 蛋白表達逐漸增強，且隨著Ad-IGF1 滴度增加呈梯度上升，Smad1/5 蛋白被激活，磷酸化水平逐漸升高。并且在不同時間點檢測BMP2 蛋白水平和磷酸化Smad1/5 水平變化，有趣的是，IGF1 可呈濃度和時間依賴性上調(diào)BMP2 表達和Smad1/5 活性。免疫組化結(jié)果也證實IGF1 可以促使磷酸化Smad1/5 從上頜竇黏膜干細胞的胞漿轉(zhuǎn)移到核內(nèi)。隨后，為進一步探討B(tài)MP-Smads 信號在IGF1 介導(dǎo)的促上頜竇黏膜干細胞成骨分化中的作用，采用Noggin 進行BMP-Smads 信號抑制。Noggin 是BMP-Smads 信號通路的直接抑制劑，其結(jié)構(gòu)上存在典型的“胱氨酸結(jié)”結(jié)構(gòu)域，線性排列的Noggin 二聚體同呈蝴蝶形的BMP 二聚體結(jié)合，形成一個較大的戒指樣結(jié)構(gòu)，能夠有效地屏蔽BMP 上的受體結(jié)合位點，抑制BMP 受體的激活和下游靶蛋白的磷酸化［11-13］。使用Noggin 處理Ad-IGF1 感染的細胞后，再對細胞進行成骨誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)與單純感染Ad-IGF1 組相比，磷酸化Smad1/5 蛋白表達量明顯降低，成骨相關(guān)標(biāo)志物Runx2、OPN 和ALP mRNA 表達量降低明顯，礦化結(jié)節(jié)明顯減少。說明BMP-Smads 信號通路是IGF1 活化成骨效應(yīng)不可或缺的。據(jù)此，本實驗研究結(jié)果表明IGF1 可通過BMP2-Smad1/5 信號通路，促進BMP2 的表達并誘導(dǎo)細胞內(nèi)Smad1/5 磷酸化和核轉(zhuǎn)位機制，調(diào)控上頜竇黏膜干細胞成骨分化效應(yīng)。

隨著對BMPs 信號通路研究增加，逐漸明確BMPs 通路可分為2 種：一種是Smads 蛋白依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這種信號傳導(dǎo)通路需通過經(jīng)典的Smads 信號分子傳遞信號；另外一種是Smads 蛋白非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這種信號傳導(dǎo)通路不直接依賴轉(zhuǎn)錄因子Smads 的激活［14-16］。更重要的是，在成骨機制研究中證實細胞成骨分化除了依賴經(jīng)典的BMP-Smads 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路外，也可通過Smads蛋白非依賴性信號通路（如MAPK、PI3K 等）進行信號傳導(dǎo)［17-18］。其中p38MAPK 是其中一條重要的通路，可以通過胞外信號激活MAPK，繼而激活MKK3/MKK6，再激活p-p38 來調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［19］?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，引起細胞增殖、分化，參與細胞的應(yīng)激反應(yīng)和介導(dǎo)細胞的骨架重構(gòu)等一系列生物學(xué)效應(yīng)，在成骨細胞分化中具有重要的調(diào)控作用［20-21］。然而p38MAPK 信號通路是否能在IGF1 介導(dǎo)下調(diào)控上頜竇黏膜干細胞的成骨效應(yīng)尚不明確。

基于此，本研究進一步探討p38MAPK 信號通路是否參與IGF1 介導(dǎo)的上頜竇黏膜干細胞成骨分化進程。 使用p38MAPK 信號通路抑制劑SB203580進行功能實驗。SB203580，4-（4 氟苯基）-2-（4-甲基亞磺酰苯基）-5-（4-吡啶基）-咪唑，一種藥理的化學(xué)合成物，可以抑制p38MAPK 對MAPK/APK-2 的激活以及后續(xù)磷酸化的級聯(lián)反應(yīng)，是p38MAPK 的選擇性抑制劑［22］。SB203580 處理Ad-IGF1 感染的細胞后成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，與單純感染Ad-IGF1 的對照組相比，磷酸化p38 水平無明顯變化，成骨標(biāo)志物Runx2、OPN 和ALP mRNA 表達水平亦無明顯變化，實驗結(jié)果提示p38MAPK 信號通路可能在IGF1 介導(dǎo)的促上頜竇黏膜干細胞成骨分化過程中并不發(fā)揮作用。SB203580 抑制效果在上頜竇黏膜干細胞中p-p38 及成骨基因變化不明顯的原因可能是因為：①SB203580 通過與ATP 結(jié)合區(qū)連接來抑制p38MAPK 的催化活性，但是不能抑制上游激酶對p38MAPK 的磷酸化［23］，因此p-p38 的表達變化不明顯；②p38MAPK 信號通路在炎癥調(diào)節(jié)及發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，其可能在上頜竇黏膜干細胞成骨分化中，其成骨效應(yīng)作用甚微，從而成骨基因變化不明顯；③不排除在上頜竇黏膜干細胞成骨分化進程中存在p38 競爭性結(jié)合因子，從而影響了抑制劑本身的藥物機理。實驗結(jié)果較傾向于p38MAPK 可能在IGF1 介導(dǎo)的上頜竇黏膜干細胞成骨過程中并不是主導(dǎo)的信號調(diào)節(jié)通路。

總之，上頜竇黏膜干細胞成骨分化過程中，IGF1 通過經(jīng)典的Smads 蛋白依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路BMP2-Smad1/5 促進成骨，而Smads 蛋白非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路p38MAPK 在IGF1 介導(dǎo)的上頜竇黏膜干細胞成骨過程中可能并不發(fā)揮作用。