盧錦斌,張利敏,徐秀容*

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院,陜西 楊凌712100；2.陜西華秦農(nóng)牧科技有限公司,陜西 楊凌712100)

蛋白質(zhì)是維持畜禽健康和生命活動的物質(zhì)基礎。畜禽的蛋白質(zhì)來源是飼料，因此飼料中蛋白質(zhì)含量的測定是生產(chǎn)的關鍵環(huán)節(jié)之一。而蛋白質(zhì)的測定方法有很多，有傳承一百多年的經(jīng)典方法，也有快速高效的新方法，但這些方法都存在一定的局限性和適用范圍。那么，不同規(guī)模的飼料、食品生產(chǎn)企業(yè)或?qū)嶒炇宜玫姆椒ㄊ欠褚恢拢拷?jīng)典的凱氏定氮法為何至今仍被廣泛應用？對經(jīng)典方法中存在的主要間題即耗時過長如何改進？本文擬對凱氏定氮法的改良研究進行綜合論述，以期回答當代凱氏定氮法的應用價值，并且對如何更快速準確測定蛋白質(zhì)含量提出討論和建議。

1 蛋白質(zhì)含量測定方法

1.1 分類

蛋白質(zhì)含量測定方法根據(jù)原理可分為間接測定法和直接測定法[1]。間接法包括凱氏定氮法、杜馬斯燃燒法等，是先測出樣品的含氮量再換算出蛋白質(zhì)含量；直接法是依據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)直接測出樣品的蛋白質(zhì)含量，如超聲波法、分光光度法及近紅外光譜法等。其中，凱氏定氮法被國際公認為測定蛋白質(zhì)含量的標準方法。

1.2 優(yōu)缺點比較

凱氏定氮法之外的其他方法都各具優(yōu)點，甚至在縮短檢測時間、提高檢測準確度、節(jié)約能源、減少污染及實現(xiàn)生產(chǎn)上的實時檢測等方面領先于凱氏定氮法，但都因存在較大的不足之處而未能廣泛應用。如：杜馬斯燃燒法的前處理簡單，可自動加樣，大大節(jié)省檢測時間和人力成本，而且在封閉的環(huán)境中進行，不會造成環(huán)境污染，是理想的蛋白質(zhì)測定方法，但由于其對反應條件的要求較高、儀器較貴且不易維修等原因，不適用于小規(guī)模企業(yè)或?qū)嶒炇遥环止夤舛确ú僮骱啽?、測定快速、準確度高，但一般只適用于檢測可溶性蛋白且對于溶液環(huán)境要求高，靈敏度易受干擾，所以不太適用于實際生產(chǎn)；近紅外光譜分析技術是無損檢測技術的一種，具有無損、快速、準確的優(yōu)點，可實現(xiàn)在線實時檢測，可檢測飼料樣品中的大多數(shù)成分，具有廣泛的應用前景，但需要提前建立足夠大的樣品數(shù)據(jù)庫，這是一個冗雜的工作，而且近紅外儀器價格昂貴，現(xiàn)階段對于大多數(shù)企業(yè)來說尚不適用。

1.3 凱氏定氮法

目前中國飼料中粗蛋白的測定標準(GB/T6432-2018)采用的便是凱氏定氮法，其原理是：樣品在濃硫酸中加熱消煮，在催化劑的作用下分解出氨氣與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，再通過堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以酸標準溶液滴定，通過消耗的酸的體積即可計算該樣品的蛋白質(zhì)含量[2]。

凱氏定氮法雖然準確，但耗時長，對樣品的消煮至少需要3 h，導致工作效率不高。并且其測定結(jié)果易受干擾，如消化時間短、消煮溫度較低或過高、蒸餾時間過短等，都會影響準確度。而樣品粉碎度、裝置封閉性等也影響結(jié)果[3-4]。此外，樣品在全過程中進行的重復性試驗也可能產(chǎn)生差異[5]。為解決這些問題，一直以來人們都在對凱氏定氮法進行改良。

2 國內(nèi)外改良研究概況

對于凱氏定氮法的改良，圍繞消煮、蒸餾及滴定3個環(huán)節(jié)進行。

2.1 消煮環(huán)節(jié)

凱氏定氮法耗時最長的環(huán)節(jié)就是消煮過程，一般至少需要3 h，有時長達6 h。消煮不僅耗時，而且消耗大量電能。因此，對消煮環(huán)節(jié)進行改良，既可以縮短時間也可以節(jié)約能源。消煮環(huán)節(jié)的改良從催化劑和消化液兩個方面入手。傳統(tǒng)凱氏定氮法催化劑為CuSO4·5H2O與K2SO4(1∶15)混合催化劑，即0.4 g CuSO4·5H2O與6 g K2SO4混勻，搭配12 mL H2SO4消化液。也有一些研究人員使用3.4 g混合催化劑搭配10 mL消化液。

2.1.1 催化劑

2.1.1.1 硒 傳統(tǒng)的凱氏定氮法大量使用混合催化劑和濃硫酸易造成環(huán)境污染。硒(Se)是常見的化學催化劑，具有價格低、反應溫和、對環(huán)境污染小等優(yōu)點。自19世紀30年代以來，Se就開始被用作凱氏定氮法中的催化劑，此后幾十年有關報道不斷[6-9]。Ashton[10]使用0.2 g的Se作為催化劑，用凱氏定氮法分別測定土壤和草中的蛋白含量，發(fā)現(xiàn)當草中轉(zhuǎn)化出的含氮量相同時，Se的催化時間比CuSO4節(jié)省90 min左右；而如果要把土壤中的氮全部轉(zhuǎn)化成硫酸銨，用Se催化最快只需3 h，而用CuSO4催化則需要24 h，結(jié)果表明以Se作為催化劑的反應時間優(yōu)于CuSO4作為催化劑的時間。Bremner[11]在綜述前人研究的基礎上對比了使用硒、汞、銅3種催化劑的凱氏定氮法測定土壤中蛋白含量的差異，發(fā)現(xiàn)3種催化劑的催化效率排序為硒>汞>銅。

陸曉濱等[12]試驗表明使用硒粉作為催化劑的最佳用量為0.15～0.20 g，并且對比了分別用硒粉和硫酸銅作催化劑對樣品的消煮效果，結(jié)果表明當達到同樣催化效率時，硒粉組用時30 min，硫酸銅組用時80 min，說明硒粉可大大提高催化效率。李萍等[13]以硒粉替代CuSO4作為催化劑測定污泥中的蛋白含量，確定了硒粉的最佳添加量為0.15 g，該條件下，當污泥中的氮素完全轉(zhuǎn)化為NH4+時，硒粉催化用時1 h，CuSO4用時1.5 h，表明該法與傳統(tǒng)凱氏定氮法相比時間縮短，且結(jié)果誤差小、穩(wěn)定可靠。在生產(chǎn)中，硒粉與K2SO4被按照一定的比例制成定氮催化片，使用更為方便。

2.1.1.2 過氧化氫 H2SO4與混合催化劑組合法消化效果好, 但在反應時容易產(chǎn)生大量泡沫，造成反應不均勻或氮素隨著泡沫溢出而損失，若不能消除泡沫，則無法實現(xiàn)快速分解。在食品檢驗中常用H2O2消泡，而適當加大H2O2的量可促使樣品快速分解，該方法稱之為雙氧水測定法。Bowman等[14]向100 mg植物組織中加入3 mL H2O2置于100 ℃預處理15 min，發(fā)現(xiàn)加入H2O2不僅起到消泡作用，還使植物中的NO3-N減少到最小，測定的準確性提高了，整個消煮過程也只用了1 h左右。苗雪原[15]采用H2O2-H2SO4-混合催化劑法對粗蛋白含量為30.4%的魚用配合飼料進行測定，將混合催化劑和H2SO4用量分別減少到3.5 g和10 mL，試樣仍可以快速分解，且消化總時間為0.5 h，檢驗結(jié)果不僅與原法高度一致，且準確度與精密度都優(yōu)于國標要求。

H2O2-H2SO4-混合催化劑法是利用H2O2部分替代混合催化劑進行反應，在實踐中該方法進一步得到改良，采用H2O2完全替代混合催化劑的方案不僅有效而且節(jié)省試劑。趙德志等[16]用H2O2替代國標法中的混合催化劑對魚粉和棉粕進行測定，不經(jīng)過消化爐消煮即可分解樣品，試驗結(jié)果與國標法的比值穩(wěn)定在1.715左右，誤差僅為0.041%，符合國標法規(guī)定的<1%。而采用該方法測定不同產(chǎn)地的同種樣品，所測值的波動性較小，穩(wěn)定性較好。

2.1.1.3 氯化鋇 強堿直接蒸餾法(Direct Distillation，俗稱DD法)是間接測定飼料蛋白含量的一種簡便方法，其與傳統(tǒng)凱氏定氮法最大區(qū)別在于將樣品在強堿溶液中消化，使其快速分解，一般采用的是氯化鋇溶液。李秀玲等[17]向裝有1 g甘薯試樣的凱式瓶中加15 mL10%氯化鋇溶液，再加40～50 mL 45%氫氧化鈉溶液，立即連接蒸餾裝置，后續(xù)操作與國標法無異。試驗測得的不穩(wěn)定氮量與國標法測得全氮量之間存在回歸方程：y=0.6934x+0.2576，相關系數(shù)r=0.9840。王濰波[18]用該法測魚粉、玉米蛋白粉和豆粕的蛋白含量，結(jié)果與國標法相差不大，標準差在允許范圍之內(nèi)，證明該方法與國標法具有相同準確度。

2.1.2 消化液 對凱氏定氮法的改良，大部分是在催化劑方面，而消化液的報道較少。傳統(tǒng)的H2SO4消化液適用于大多數(shù)樣品，但有時候消化能力有限。據(jù)梁芳珍[19]考證，Betay于1974年利用H2SO4-HClO4混合消化液測定植物樣品含氮量，能縮短消化時間，但用于無腺棉仁的效果不足。其在此體系基礎之上，提出用H2SO4-HClO4-H2O2混合體系測定無腺棉仁蛋白含量，結(jié)果比標準值略低，但在誤差范圍內(nèi)。

2.2 蒸餾環(huán)節(jié)

傳統(tǒng)的凱氏定氮法用的是手動蒸餾裝置，一般常用的是半微量蒸餾法。隨著設備制造技術的發(fā)展，半自動凱氏定氮儀和全自動凱氏定氮儀相繼問世，凱氏定氮法的自動化程度提高。

2.2.1 半自動定氮儀 半自動凱氏定氮儀是自動進行蒸餾過程的裝置，樣品消煮完后放入定氮儀中，關閉安全門，啟動程序，機器即可自動對樣品進行加試劑、蒸餾。半自動凱氏定氮儀的應用是對人力的一大解放，也使得測定的精確度大大提高。羅源[20]使用KDY-04(A)半自動定氮儀測定不同種類樣品的蛋白含量，測定結(jié)果與凱氏定氮法相比無顯著差異，精密度和準確度均理想。張曉影等[21]指出不同檢測人員使用半自動定氮儀所測結(jié)果符合允許誤差范圍，滿足試驗要求。半自動定氮儀自動化程度高、精確度高且價格便宜，能滿足大多數(shù)飼料生產(chǎn)企業(yè)的使用需求。但使用前后要進行空蒸，以清洗管道、降低誤差[22]。

2.2.2 全自動定氮儀 全自動定氮儀的自動化程度比半自動定氮儀更高，不僅可以自動加試劑自動蒸餾，還可以自動滴定、自動計算。蔣江虹等[23]報道用FOSS2300型全自動定氮儀測定大豆樣品結(jié)果與經(jīng)典方法無顯著差異，認為該法有效減少人為操作誤差帶來的影響，可作為優(yōu)選方法推廣使用。黃瑾等[24]用BuchiK-370全自動定氮儀測定不同濃度的飼料蛋白含量，準確度高，與半微量蒸餾法的最大相對偏差僅為0.51%，也說明了全自動定氮儀的使用價值。但全自動定氮儀較為昂貴，小規(guī)模企業(yè)或?qū)嶒炇铱赡懿痪邆滟徶脳l件。

2.3 滴定環(huán)節(jié)

傳統(tǒng)凱氏定氮法的滴定，是在試樣的蒸餾分解液中加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，再用0.1 mol/L或0.02 mol/L的鹽酸標準溶液進行滴定，當溶液由藍色變?yōu)榛壹t色時為滴定終點，此時根據(jù)鹽酸的消耗體積進行計算，從而得出數(shù)值。在前人的改良中，常見的是替換指示劑和標準溶液，也有采用酸度計標定的。

2.3.1 指示劑與標準溶液 凱氏定氮法的指示劑一般是甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，是甲基紅0.1%乙醇溶液與溴甲酚綠0.5%乙醇溶液等體積混合而來，常見的還有用甲基紅-次甲基藍混合指示劑。Scanlan[25]在測定皮革和面筋中的氮含量時，選擇苯甲酰胺作為指示劑，試驗證明苯甲酰胺作為指示劑優(yōu)于甲基紅指示劑。趙德志[16]在使用雙氧水測定法時，使用酚酞試劑作為新方法的指示劑，作為對照的傳統(tǒng)方法依然用混合指示劑，但是其沒有對此進行詳細說明。

李維美等[26]測定樣品蛋白含量，消煮、蒸餾步驟與傳統(tǒng)凱氏定氮法一樣，僅在滴定階段利用碘酸氫鉀標準溶液替代鹽酸標準溶液，測定結(jié)果變異系數(shù)0.35%比傳統(tǒng)方法要小，準確度高。

2.3.2 酸度計 酸度計又稱作pH計，是測定溶液酸堿度的儀器，具有快速、精確的優(yōu)點。賈麗艷等[27]在測定綠豆粉蛋白含量的滴定過程中，將酸度計法與混合指示劑法進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法測得的結(jié)果相近，準確度和精密度都符合要求。

3 小 結(jié)

凱氏定氮法作為測定蛋白含量的經(jīng)典方法，在無損檢測技術廣泛應用的時代仍然具有應用價值和代表性。本文探討了凱氏定氮法3個環(huán)節(jié)的改良問題，實際上關于凱氏定氮法改良的重點是關于消煮環(huán)節(jié)的改進，如何高效催化樣品又不造成氮的損失是研究這一問題的關鍵。

研究人員對于凱氏定氮法的改良主要集中在縮短檢測時間和提高準確度這兩點，但不同改良方法對于不同樣品所測結(jié)果可能不同。本文總結(jié)前人的研究，提出在凱氏定氮法改良領域尚待解決的一些問題：(1)是否存在一種對于不同飼料原料來說都適用且在縮短檢測時間和提高準確度上面都具有優(yōu)勢的改良方案？(2)目前的改良法大多針對單個環(huán)節(jié)進行改良，而把不同環(huán)節(jié)改良法組合起來的改良方案是否更具有檢測方面的優(yōu)勢？(3)不經(jīng)過消化爐消煮即可分解樣品的改良方案其準確性究竟如何，是否具有可行性？因此，凱氏定氮法的改良還可以進一步探討。