陳珊珊， 朱 鐳， 郭 超， 徐 輝， 郭琳琳， 王穎穎， 孟晉華

流感嗜血桿菌是兒童社區(qū)獲得性感染的常見病原菌，僅次于肺炎鏈球菌。該菌主要引起兒童呼吸道感染，其次可引起患兒中耳炎、蜂窩組織炎、關(guān)節(jié)炎、化膿性腦膜炎、血流感染等多種疾病，嚴(yán)重威脅兒童的身體健康[1-2]。近年來，隨著抗生素在臨床的廣泛應(yīng)用，流感嗜血桿菌的耐藥菌株逐漸增多。流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林耐藥率也逐年上升，耐藥程度日益嚴(yán)重[3]。本研究通過對(duì)山西省兒童醫(yī)院2018年患兒臨床分離的1 320株流感嗜血桿菌進(jìn)行回顧性調(diào)查研究，分析其分布、流行特點(diǎn)及耐藥情況，為臨床經(jīng)驗(yàn)診治提供科學(xué)依 據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2018年1-12月山西省兒童醫(yī)院微生物室在患兒各類標(biāo)本中共檢出流感嗜血桿菌 1 320株（剔除同一患兒相同部位的重復(fù)菌株）。

1.1.2 試劑及儀器 菌株分離采用巧克力平皿，藥敏試驗(yàn)采用HTM培養(yǎng)基，均購自鄭州安圖生物公司，血培養(yǎng)瓶和腦脊液培養(yǎng)瓶分別由法國(guó)梅里埃公司和美國(guó)BD公司提供。采用質(zhì)譜儀鑒定流感嗜血桿菌，儀器購自法國(guó)梅里埃公司。β內(nèi)酰胺酶檢測(cè)的頭孢硝噻吩紙片為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品。藥敏試驗(yàn)選用9種抗菌藥物，藥敏紙片均購自英國(guó)OXOID公司。

1.1.3 質(zhì)控菌株 流感嗜血桿菌質(zhì)譜鑒定質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 8739，藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為流感嗜血桿菌ATCC 49247。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離和鑒定 按照操作規(guī)范，將經(jīng)過評(píng)估合格的痰標(biāo)本及其他各類標(biāo)本以分區(qū)劃線法接種于血平皿和巧克力平皿，置 35 ℃、含 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，挑取巧克力平皿上圓形透明或半透明、濕潤(rùn)、邊緣整齊的可疑流感嗜血桿菌菌落，接種于巧克力平皿上，35 ℃、5% CO2孵育24 h。24 h后采用質(zhì)譜儀鑒定分純菌株，置信區(qū)間在99.0%～99.9%內(nèi)可鑒定為流感嗜血桿 菌。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)9 種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并按照2017年美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀[4]。β內(nèi)酰胺酶檢測(cè)采用頭孢硝噻吩紙片刮取平皿上少量菌落，若1 min內(nèi)紙片變紅則為產(chǎn)酶陽性，若不變紅則為陰性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 使用WHONET 5.6和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布

2.1.1 性別、年齡分布 分離的1 320株流感嗜血桿菌中，分離自男性患兒735株（55.7%），女性患兒585株（44.3%）。分離自1歲以下嬰兒510株（38.6%），1～3歲534株（40.5%），4～6歲157株（11.9%），7～16歲119株（9.0%）。

2.1.2 門診和住院患者分布 1 320株流感嗜血桿菌分離自住院患者為92.0%（1 214/1 320），106株分離自門診患者（8.0%），且主要分離自女性患兒陰道分泌物，占83.0% （88/106）。

2.1.3 季節(jié)分布 流感嗜血桿菌主要在冬春季流行，共分離907株，占全年1 320分離株的68.7%，其次為夏季，246株（18.6%），而秋季最少，為167株（12.7%）。見圖1。

2.1.4 標(biāo)本類型分布 檢出的1 320株流感嗜血桿菌主要來自痰液標(biāo)本（痰標(biāo)本由吸痰器吸得且涂片合格），占90.1% （1 189/1 320），其次為陰道分泌物，占6.7%（88/1 320）。此外，肺泡灌洗液13株（1.0%），膿液標(biāo)本20株（1.5%），血液標(biāo)本6株（0.5%），腦脊液和尿液標(biāo)本各2株，分別占0.2%。其中血和腦脊液標(biāo)本同時(shí)分離出流感嗜血桿菌1例，陰道分泌物和尿液標(biāo)本同時(shí)檢出者2 例。

2.2 β內(nèi)酰胺酶檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)

2.2.1 β內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果 剔除同一患者不同部位重復(fù)菌株后，分離的1 317株流感嗜血桿菌中，β內(nèi)酰胺酶陽性株733株，占55.7%，β內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥株（β-lactamase-negative and ampicillin-resistant，BLNAR）89株，占6.8%（89/1 317）。

圖1 流感嗜血桿菌季節(jié)分布情況Figure 1 Seasonal distribution of Haemophilus infl uenzae isolates

表1 2018 年1 317 株兒童流感嗜血桿分離株菌對(duì)抗菌藥物的敏感率和耐藥率Table 1 Antimicrobial susceptibility of 1 317 Haemophilus inf luenzae isolates from children in 2018（%）

2.2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 分離菌株對(duì)抗菌藥物的藥敏結(jié)果見表1。未檢出對(duì)第三代頭孢菌素、美羅培南、左氧氟沙星不敏感的流感嗜血桿菌。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用χ2檢驗(yàn)比較β內(nèi)酰胺酶陽性氨芐西林耐藥組（β-lactamase-positive and ampicillin-resistant，BLPAR）、β內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林敏感組（β-lactamase-negative and ampicillinsensitive，BLNAS） 以及BLNAR組藥物敏感率，發(fā)現(xiàn)三者對(duì)阿莫西林-克拉維酸（χ2= 258.0，P＜0.01）、頭孢呋辛（χ2=180.5，P＜0.01）、阿奇霉素（χ2= 143.0，P＜0.01）、甲氧芐啶-磺胺甲唑（χ2=19.9，P＜0.01）耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。

3 討論

本研究顯示2018年我院兒童患者流感嗜血桿菌的分離株較多，計(jì)1 320株，較2017年（837例）有所升高。分析原因如下：①門診標(biāo)本送檢數(shù)量有所增加，尤其是女童陰道分泌物標(biāo)本。近年來，我院患兒陰道分泌物流感嗜血桿菌檢出率有所提高，門診醫(yī)師逐漸意識(shí)到陰道分泌物標(biāo)本送檢的重要性。2018年流感嗜血桿菌占門診兒童陰道分泌物主要分離菌第1位。此外，住院患兒痰標(biāo)本中流感嗜血桿菌的檢出率也有大幅提升；②臨床醫(yī)師微生物標(biāo)本的送檢意識(shí)提高，對(duì)標(biāo)本采集要求也有了一定認(rèn)識(shí)，特別是盡量在抗菌藥物使用前送檢標(biāo)本；③對(duì)本室工作人員加強(qiáng)培訓(xùn)，提高了微生物室人員對(duì)流感嗜血桿菌鑒別分離的能力；④本室選擇多家培養(yǎng)基進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，采用流感嗜血桿菌生長(zhǎng)最佳的巧克力培養(yǎng)基，使流感嗜血桿菌的初篩分離率得到顯著提高；⑤對(duì)腦脊液常規(guī)檢測(cè)的異常標(biāo)本除采用腦脊液培養(yǎng)瓶培養(yǎng)外，將離心后的沉淀物接種至血平皿及巧克力平皿培養(yǎng)，此外，對(duì)于鏡下形態(tài)高度懷疑流感嗜血桿菌或血培養(yǎng)檢出流感嗜血桿菌但腦脊液未報(bào)陽者及時(shí)向腦脊液培養(yǎng)瓶中添加新鮮血液，提高了腦脊液流感嗜血桿菌的檢出率。

本研究中男性患兒流感嗜血桿菌感染所占比例稍高于女性患兒，提示男性兒童可能較易受該菌感染，與甄楊等[5]、程薇等[6]的報(bào)道結(jié)果一致。年齡分布顯示，我院流感嗜血桿菌感染患兒以3歲以下嬰幼兒為主，占79.1%，可能與其肺功能及免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未健全有至關(guān)重要的關(guān)系。因此，需要及時(shí)接種流感嗜血桿菌疫苗，預(yù)防流感嗜血桿菌感染的發(fā)生。多個(gè)研究顯示，流感嗜血桿菌感染呈明顯的季節(jié)性分布，好發(fā)于冬春季[7-8]。本組資料顯示，我院冬春季共檢出907株流感嗜血桿菌，占全年分離株的68.7%，可能與北方冬春季寒冷空氣使兒童黏膜局部免疫受損有關(guān)。

流感嗜血桿菌是條件致病菌，常定植于正常人鼻咽部，以學(xué)齡前兒童的定植率最高，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，可侵入下呼吸道引起感染[9]。本研究顯示流感嗜血桿菌主要分離自下呼吸道，其中痰標(biāo)本最多，占總分離株的90.1%（1 189/1 320），肺泡灌洗液共檢出13株。陰道分泌物是除呼吸道標(biāo)本外比率較高的標(biāo)本類型，共分離出88株，占總分離株的6.7%?；純耗挲g范圍為7個(gè)月齡～11歲，主要集中在3～7歲學(xué)齡前兒童。有國(guó)外報(bào)道稱流感嗜血桿菌是引起青春期前女孩外陰陰道炎的最常見致病菌[10]，國(guó)內(nèi)盧文敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌占陰道炎患兒陰道分泌物分離株的第2位，僅次于大腸埃希菌。本研究顯示，我院兒童陰道分泌物培養(yǎng)的致病菌中，流感嗜血桿菌的檢出率居首位，與鐘華敏等[12]結(jié)果一致。中耳炎、外科創(chuàng)傷等膿性分泌物中所占比例僅次于陰道分泌物，占1.5% （20/1 320）。值得關(guān)注的是，尿液標(biāo)本共檢出2例，且這2例患兒陰道分泌物均檢出流感嗜血桿菌。

氨芐西林曾是治療流感嗜血桿菌感染的首選藥物。近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率逐漸升高，耐藥程度也日益嚴(yán)重[3]。本組資料顯示2018年我院流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林耐藥率高達(dá)62.5%。目前，公認(rèn)的流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林耐藥機(jī)制主要有兩種，其中產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是其最常見的作用機(jī)制[13]。非產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林耐藥可由ftsI基因點(diǎn)突變影響青霉素結(jié)合蛋白（PBP），使PBP對(duì)抗生素的親和力降低，此種耐藥株稱為BLNAR株[14]，本研究檢出89株，僅占6.8%（89/1 317），提示我院2018年流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥機(jī)制仍以產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶為主，氨芐西林已不再適合作為治療流感嗜血桿菌感染的首選藥物。此外，統(tǒng)計(jì)分析顯示β內(nèi)酰胺酶陽性菌株對(duì)阿莫西林-克拉維酸、頭孢呋辛、阿奇霉素和甲氧芐啶-磺胺甲唑的敏感率明顯低于β內(nèi)酰胺酶陰性菌株。

本研究數(shù)據(jù)顯示流感嗜血桿菌對(duì)頭孢呋辛的耐藥率為32.3%，較2017年（29.5%）和2016年（27.5%）有所上升。這一結(jié)果提示對(duì)于部分輕中度感染的患兒在第二代頭孢菌素類抗生素經(jīng)驗(yàn)用藥前應(yīng)及時(shí)送檢疑診感染部位的標(biāo)本，同時(shí)應(yīng)密切注意患兒的體征改變和臨床微生物室檢驗(yàn)報(bào)告，轉(zhuǎn)為目標(biāo)治療。阿莫西林-克拉維酸作為常用的口服抗生素，細(xì)菌對(duì)其敏感率較高，為92.8%，罕見對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟不敏感株，敏感率達(dá)100%，說明我院流感嗜血桿菌分離株對(duì)第三代頭孢菌素和含酶抑制劑的復(fù)合制劑保持較高敏感率，可作為經(jīng)驗(yàn)性治療的首選藥物。此外，未發(fā)現(xiàn)對(duì)美羅培南的不敏感株，提示碳青霉烯類對(duì)流感嗜血桿菌有較強(qiáng)的抗菌活性，但并不主張將其作為治療的首選藥物，以避免抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生。所有菌株中未見左氧氟沙星的不敏感菌株，這可能與兒童患者因用藥安全問題很少選擇該種抗菌藥物有關(guān)。分離株對(duì)阿奇霉素的非敏感率為28.8%，敏感率為71.2%，與CHINET 2017年兒童株流感嗜血桿菌阿奇霉素26.1%的非敏感率較為接近[15]。在所有抗菌藥物中對(duì)甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率最高，達(dá)67.0%，臨床不宜選用。

綜上所述，我院流感嗜血桿菌菌株主要來自下呼吸道，3歲以下嬰幼兒為易感人群，冬春季為感染高發(fā)季節(jié)。菌株對(duì)氨芐西林的高耐藥率與β內(nèi)酰胺酶高產(chǎn)酶率有關(guān)，使得氨芐西林已不能作為臨床一線用藥。臨床醫(yī)師在經(jīng)驗(yàn)性治療時(shí)可首選第二代、第三代頭孢菌素和加酶抑制劑的復(fù)合制劑，但因第二代頭孢菌素如頭孢呋辛的耐藥率有逐年上升的趨勢(shì)，應(yīng)在用藥前盡快送檢患兒可疑感染部位的標(biāo)本并及時(shí)根據(jù)微生物室提供的藥敏結(jié)果合理選擇抗菌藥物。這樣不僅有利于患者療效的提高，也利于控制臨床耐藥菌株的增長(zhǎng)速度。