韋雪梅，郭義龍，徐志新

供體心臟通常需要經(jīng)過一定時間的保存才能進行移植，此時離體心臟的保存技術可能對受體心臟發(fā)生缺血再灌注損傷和急性排斥反應產(chǎn)生重要影響[1]。再灌注損傷和急性排斥反應也是導致心臟移植失敗、受體心臟復跳欠佳和失能的主要機制[2-3]。低溫和HTK停搏保護液是目前應用最成熟的離體心臟保存技術，可顯著降低心肌能耗，保護心肌功能[4]。其中HTK液單純低溫浸泡應用最廣泛，簡單、安全，缺點是不能及時清除停搏期間心肌組織代謝產(chǎn)物和氧自由基，補充心肌代謝需要，導致鈣超載、細胞水腫、炎癥反應、氧化應激、免疫損傷等[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，持續(xù)灌注或間斷2 h灌注可明顯改善復跳效果，降低心律失常和心肌損傷風險，提高受體心臟存活率。細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule, ICAM)-1和白細胞介素(interleukin, IL)-17的表達在同種異體心臟移植早期再灌注損傷和急性排斥反應過程中表達明顯上調(diào)，可能參與受體心臟存活和功能恢復過程[8-9]。既往關于HTK液不同灌注方式對移植心臟受體心肌免疫損傷和炎癥反應的研究較少，因此，該研究通過比較HTK液3種不同灌注方法對同種異體兔心保存移植后心肌組織ICAM-1和IL-17表達的影響，探討HTK液灌注方式對心臟移植后急性排斥反應的影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 18對36只2個月大小雌雄不限的健康新西蘭兔購于長沙市天勤生物技術有限公司，供受體配對，平均體質(zhì)量(2.15±0.33)kg，合格證號43006700016096數(shù)量10只，合格證號43006700016142數(shù)量10只，合格證號43006700016249數(shù)量16只。由我院動物實驗中心購買和飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：通風透氣，除添水、添料、清掃衛(wèi)生和觀察健康的時間外，兔舍內(nèi)均保持黑暗。兔舍溫度保持25 ℃左右，濕度55%～65%。

1.1.2實驗試劑與儀器 HTK灌注液和KH緩沖液(德國科勒化學制藥公司)，TRIzol提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑(美國Sigma公司)，HE染色試劑和ECL顯色液(南京碧云天有限公司)，BCA蛋白提取試劑(美國Invitrogen 公司)，鼠抗兔ICAM-1、IL-17和GAPDH一抗和二抗(美國R&D公司)，TUNEL試劑(美國Santa Cruz公司)。顯微外科手術器械(上海醫(yī)用器械廠)，離體心臟灌流系統(tǒng)(上海奧爾科特生物公司)。

1.2 實驗方法18對實驗兔隨機抓取分為3組，分別是單純低溫浸泡組(單純組)5對、持續(xù)灌注組(持續(xù)組)5對和間斷2 h灌注組(間斷組)8對。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，氣管插管人工呼吸，靜脈肝素化，開胸阻斷主動脈，灌注HTK保護液，剪斷上下腔靜脈及肺動脈充分引流，離體取出心臟，經(jīng)主動脈根部灌注HTK停跳液保護心臟，懸掛于Langendorff灌注模型上。首先對離體心臟進行平衡灌注，采用KH緩沖液(37 ℃、pH 7.4)經(jīng)95% O2+5% CO2預處理，灌注壓力為7.35 kPa，5～10 min后心臟搏動處于穩(wěn)定狀態(tài)，然后進行停跳灌注。單純組灌注HTK保護液(4 ℃、5～6 ml)后靜置保存，間斷組間隔2 h灌注HTK保護液(30 ml/kg)，持續(xù)組采用微量泵，灌注速度0.025 ml/(g·h)；處理完成后于4 ℃保存8 h。建立移植心臟模型參照改良Ono術式[10]，即分別將供心升主動脈與受體腹主動脈端端吻合，供心肺動脈與受體下腔靜脈吻合，建立在體動靜脈循環(huán)。

對心臟移植供、受體進行血型、HLA抗原、淋巴細胞毒及群體反應性抗體等檢測，采用氨基酸三聯(lián)體及交叉反應方法對供、受者匹配程度進行評價。

1.3 觀察指標與檢測方法根據(jù)改良Ono術式完成心臟移植模型，取出供體心臟。常規(guī)制作心肌切片，厚度5 μm，石蠟包埋，用于HE染色觀察組織和細胞的病理改變；分別采用實時定量RT-PCR和蛋白印跡法檢測組織ICAM-1和IL-17水平，TUNEL試劑檢測細胞凋亡率。

TUNEL檢測細胞凋亡主要步驟：石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、H2O2封閉抗體、蛋白酶消化、緩沖液保濕等處理后；根據(jù)說明書提示，首先取出Td T和DIG-d-UTP各1 μl，與緩沖液混勻，濕盒內(nèi)37 ℃反應2 h；洗滌后滴加生物素-抗地高辛抗體反應30 min，洗滌后滴加SABC反應30 min，DAB顯色。凋亡細胞的判斷以胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，凋亡率計算方法：每例標本隨機挑選5張切片，每張切片隨機挑選4個高倍鏡視野(400×)人工計數(shù)，凋亡細胞占所有視野下細胞百分比即凋亡率，取平均值。

RT-PCR法主要步驟：根據(jù)試劑操作提示提取總RNA，測定濃度和純度，合成cDNA；由專業(yè)生物公司設計目的引物序列，ICAM-1:(F)5′-GGAATTGGAGGAGAGCA-3′,(R)5′-ACAGATCCTCAATCTT-3′,123 bp;IL-17:(F)5′-AACGGCTCTTGGCT-3′,(R)5′-GTTAAGGCAGACCGCA-3′,252 bp;GAPDH:(F):5′-CGAGCCGATGACAG-3′,(R):5′-GCTGTGCGCGTAT-3′, 69 bp。PCR擴增體系為Master Mix 10 μl+上下游引物各0.5 μl+cDNA模板1 μl，加反應水至20 μl。擴增條件為95 ℃、5 min，(95 ℃、25 s、60 ℃、30 s)共30個循環(huán)，60 ℃、40 s終止反應，電泳擴增產(chǎn)物，獲得融解曲線，系統(tǒng)軟件自動計算Ct值，結果以2-△△Ct法表示。

Western blot主要步驟：加入細胞裂解液，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，參照蛋白GAPDH作標準化處理；各組分別取30 μg樣品蛋白，經(jīng)8% SDS-PAGE上樣加熱，分離電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，搖床室溫封閉；洗滌后滴加鼠抗兔ICAM-1、IL-17和GAPDH抗體(1 ∶2 000)靜置過夜，洗滌后滴加辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗(1 ∶500)室溫孵育4 h，ECL顯色，結果行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理以SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對計量資料作單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗，3組間比較采用F檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組HE染色結果比較HE染色發(fā)現(xiàn)，3組大部分心肌組織結構完整，伴細胞水腫、黏液樣變性或壞死、炎性細胞浸潤、脂肪化生及小血管生成。見圖1。半定量分析發(fā)現(xiàn)，間斷組細胞水腫、炎性細胞和小血管數(shù)目明顯少于持續(xù)組，單純組最多(P<0.05)。見表1。

圖1 HE染色觀察各組心肌組織的病理改變 ×200

表1 HE染色半定量分析各組心肌組織的

與單純組比較:aP<0.05；與持續(xù)組比較:bP<0.05

2.2 各組心肌組織ICAM-1和IL-17 mRNAs和蛋白表達水平的比較間斷組ICAM-1和IL-17 mRNAs和蛋白表達水平顯著低于持續(xù)組，單純組最高(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組心肌組織ICAM-1和IL-17 mRNAs和

與單純組比較:aP<0.05；與持續(xù)組比較:bP<0.05

2.3 各組心肌細胞凋亡率的比較間斷組細胞凋亡率低于持續(xù)組，單純組最高(P<0.05)。見圖3、4。

3 討論

臨床和實驗中需要挑選最佳的心臟停搏保護液，其中HTK液單次低溫灌注可實現(xiàn)較低的心臟基礎代謝，提供必要的心肌代謝底物和氧氣，不增加心肌損傷和心臟移植后的功能障礙，而且易制備、操作簡單、安全性高。良好的供體心臟保存技術是移植心臟得以存活的重要環(huán)節(jié)。HTK液灌注不僅持續(xù)提供停搏期間心肌代謝需要的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時可及時清除代謝產(chǎn)物，減輕酸堿失衡、細胞水腫、氧化功能障礙、炎癥反應等損傷[10]。該研究提出HTK液不同灌注方式可能對受體移植心臟的再灌注損傷和急性排斥反應可能產(chǎn)生不同的影響，進而影響心臟復跳后的功能恢復。

圖2 Western blot法半定量比較各組心肌組織ICAM-1和IL-17蛋白表達水平 ×200

本研究顯示，3組大部分心肌組織結構完整，伴細胞水腫、黏液樣變性或壞死，炎性細胞浸潤、脂肪化生及小血管生成。提示停跳期間心肌細胞保持低水平的能量代謝，離體對心肌細胞產(chǎn)生一定的影響，如無氧糖酵解、細胞腫脹、鈣超載、氧自由基產(chǎn)生過多、炎性細胞浸潤、新生血管等。半定量分析表明，間斷組細胞水腫、炎性細胞和小血管數(shù)目明顯少于持續(xù)組，單純組最多。提示間斷灌注對心肌損傷程度較輕。進一步研究顯示，間斷組ICAM-1和IL-17 mRNAs和蛋白表達水平顯著低于持續(xù)組，單純組最高。急性排斥反應是移植心臟較常見的并發(fā)癥，也是受體心臟復跳失敗和失能以及慢性排斥反應的重要原因。ICAM-1主要識別白細胞表面的特定結構，具有高度特異性，進而趨化白細胞、淋巴細胞聚集，發(fā)揮殺傷外源性分子，介導細胞間黏附功能，在免疫反應、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物行為中扮演重要角色[11]。在移植物免疫排斥反應中，受體器官可高表達ICAM-1，與排斥反應時間相一致，其升高水平與細胞毒性T淋巴細胞的功能活化程度密切相關[12]。此外，ICAM-1可協(xié)同抗原呈遞細胞共同識別異源性分子，激活細胞和體液免疫反應。具體反應過程是在免疫識別階段，ICAM-1強化輔助性T細胞和抗原提呈細胞的黏附、聚集活性，趨化有活性T細胞向移植物內(nèi)皮細胞黏附，增加內(nèi)皮細胞損傷，增加血管壁通透性，釋放多種細胞因子和炎癥介質(zhì)，如IL-17、TNF-α[13]；免疫效應階段主要強化毒性T細胞與移植物細胞黏附和殺傷作用，導致移植物細胞功能障礙，凋亡增加。IL-17主要由輔助性T淋巴細胞分泌，在抗原呈遞、介導細胞毒性T細胞和NK細胞殺傷病原體和異源性細胞、激活B淋巴細胞中發(fā)揮重要作用[14]。間斷組細胞凋亡率低于持續(xù)組，單純組最高。細胞凋亡是再灌注損傷、急性排斥反應、供體復跳失敗的重要機制，也是供體心臟功能恢復不佳的重要原因。

圖3 TUNEL比色法檢測心肌凋亡 ×400

圖4 TUNEL法檢測各組心肌細胞凋亡率

與單純組比較：#P<0.05；與連續(xù)組比較：*P<0.05

綜上所述，HTK液不同灌注方法對同種異體兔心移植后的急性排斥反應影響不同，以間斷2 h灌注可明顯降低受體心肌ICAM-1和IL-17表達，抑制細胞凋亡效應最明顯。移植心臟后功能是否能夠恢復至移植前的影響因素和參與機制較多，如何探尋特異性的干預靶點，對提高供體保存技術和受體移植物存貨質(zhì)量具有十分重要的意義。