鮑穎超， 高 翔， 徐 龍2，蔣正軒，陶黎明

葡萄膜炎是一種以葡萄膜炎癥為特征的疾病，被認(rèn)為是眼睛中血管層的炎癥，是虹膜、睫狀體及脈絡(luò)膜組織炎癥的總稱。其眼部并發(fā)癥包括帶狀角膜變性、角膜水腫、囊樣黃斑水腫、白內(nèi)障、青光眼以及視網(wǎng)膜脫離等，這些與葡萄膜炎相關(guān)的并發(fā)癥可導(dǎo)致的嚴(yán)重視力損失[1-2]。

中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)，又稱armet，是一種新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的表達(dá)尤為豐富，并且受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)[3-4]。盡管它可以保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，也可以調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和免疫反應(yīng)，以促進(jìn)組織修復(fù)和再生[5-6]，但很少有關(guān)于MANF在葡萄膜炎中作用的研究。Gao et al[7]的研究中首次證明MANF在小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)，并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)視網(wǎng)膜組織修復(fù)和成功再生。由此推斷，MANF可使免疫細(xì)胞偏向于抗炎表型，具有保守的免疫調(diào)節(jié)功能，能促進(jìn)脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的組織修復(fù)，并具有加強(qiáng)視網(wǎng)膜再生治療的作用?，F(xiàn)設(shè)計(jì)如下試驗(yàn)，以驗(yàn)證此假說。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～ 8周齡雄性Lewis大鼠30只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。實(shí)驗(yàn)前在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)1周，所有動(dòng)物均自由飲水和飲食。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)及使用均遵循國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP)1169-1191(上海生工)；含有5 mg/ml結(jié)核桿菌的完全福氏佐劑(complete freund adjuvant，CFA)、百日咳毒素(美國Sigma公司)；大鼠中腦膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白(美國Novus 公司)。Davidson’s fixative(北京索萊寶公司)；TRIzol Reagent(美國Ambion公司)；熒光定量染料、DNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒(日本Takara公司)；其余常見試劑和耗材均來自安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室。

1.3 方法

1.3.1大鼠自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)模型的建立以及MANF的注射 根據(jù)文獻(xiàn)[8]所述方法構(gòu)建大鼠EAU。MANF以粉末形式溶解于磷酸鹽(phosphate buffered saline，PBS)中。將大鼠分為3組，即正常組、實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只。其中，實(shí)驗(yàn)組藥物為MANF(2 μg/μl)，對照組藥物為PBS(陽性對照)。正常組不做任何處理；實(shí)驗(yàn)組的大鼠，免疫后第3、7、11天通過玻璃體腔注MANF(2 μg/μl)，2 μl每只眼[5-9]；對照組大鼠免疫后第3、7、11天通過玻璃體腔注PBS,2 μl每只眼。

1.3.2裂隙燈顯微鏡下觀察眼前節(jié)炎癥反應(yīng) 從免疫后第7天起，每天用裂隙燈顯微鏡觀察并進(jìn)行每組眼內(nèi)炎癥的臨床評價(jià)和臨床評分。參照Caspi的臨床分級標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行評分并記錄。評分細(xì)則如下，0分：正常，未見明顯炎癥；0.5分：虹膜血管擴(kuò)張；1分：虹膜中度充血，瞳孔收縮異常；2分：前房輕度渾濁；3分：中度不透明的前房伴暗紅色反射，瞳孔縮小；4分：可見前房積膿，瞳孔膜閉，視網(wǎng)膜紅光反射消失。

1.3.3視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)中的Lewis大鼠在IRBP免疫后第14天處死大鼠后立即摘取眼球(注意保留2 mm的視神經(jīng))固定在Davidson’s fixative中，石蠟包埋，平行于視神經(jīng)方向進(jìn)行切片，HE染色。在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，并參照Caspi組織病理學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行評分?；谝暰W(wǎng)膜炎性細(xì)胞浸潤程度，將通過0分(無炎癥)至4分(炎癥最大程度)進(jìn)行評分。

1.3.4RT-qPCR檢測 實(shí)驗(yàn)中的Lewis大鼠在IRBP免疫后第14天，處死大鼠后摘取眼球，根據(jù)文獻(xiàn)所述方法[11]：①提取眼球組織的總mRNA；②逆轉(zhuǎn)錄(mRNA→cDNA)；③ RT-qPCR 按照SYBR Premix Ex Taq II定量PCR試劑盒的操作步驟進(jìn)行操作；④ 結(jié)果:以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算各趨化因子mRNA相對表達(dá)量，并采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠眼前節(jié)炎癥分級通過裂隙燈觀察，免疫前實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠眼前節(jié)，虹膜血管正常，未見炎癥反應(yīng)，對光反射亦正常(圖1A、B)。免疫后第7天，對照組可見大鼠眼前節(jié)出現(xiàn)有明顯的虹膜充血和瞳孔阻塞(圖1C)；實(shí)驗(yàn)組可見虹膜輕度充血，瞳孔無明顯改變(圖1D)。免疫后第14天，對照組可見角膜水腫，虹膜嚴(yán)重充血，瞳孔阻塞且有明顯新生血管(圖1E)；實(shí)驗(yàn)組僅見虹膜輕度充血，少量新生血管(圖1F)。大鼠眼前節(jié)臨床評分實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組(圖2)。

圖1 免疫后第0、7、14天對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠眼前節(jié)進(jìn)行裂隙燈顯微鏡觀察 ×10

圖2 炎癥高峰期(免疫后第14天)對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠眼前節(jié)臨床表現(xiàn)評分曲線

2.2 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)炎癥情況EAU發(fā)病高峰期(免疫后第14天)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化和病理組織學(xué)評分如圖3所示。HE染色顯示，正常組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)規(guī)律，各層分界清楚(圖3A a)；對照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂、松散，內(nèi)核層與外核層中間位置長出大量新生血管，部分結(jié)構(gòu)模糊(圖3A b)。而實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，僅有少量新生血管(圖3A c)。病理組織學(xué)評分顯示實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對照組(P<0.01)，見圖3B。

圖3 免疫后第14天組織病理學(xué)觀察

A：不同組大鼠免疫后第14天眼球組織切片HE染色結(jié)果 ×200；a: 正常組大鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)；b：對照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)；c: 實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)(黑色箭頭:視網(wǎng)膜新生血管；白色箭頭:炎癥細(xì)胞浸潤圖); B: 不同組大鼠病理組織學(xué)評分；與對照組比較：**P<0.01

2.3 RT-qPCR法檢測眼球炎癥因子mRNA的表達(dá)情況結(jié)果顯示，IL-17、INF-γ的mRNA分別在免疫后的第14天，正常組、實(shí)驗(yàn)組和對照組表達(dá)水平存在差異。對照組兩者的表達(dá)水平明顯高于正常組，而實(shí)驗(yàn)組兩者表達(dá)水平升高幅度低于對照組(圖4A、B)。

3 討論

葡萄膜炎的遺傳與易感性與免疫應(yīng)答中的T細(xì)胞和B細(xì)胞受累、細(xì)胞因子和趨化因子信號和信號通路以及環(huán)境影響有關(guān)[12]。目前已知的研究[13]結(jié)果表明，在葡萄膜炎發(fā)病過程中T細(xì)胞受體介導(dǎo)初始的CD4+T分化為Th1、Th2、Th17和Treg四個(gè)主要細(xì)胞亞型。其中Th1細(xì)胞分泌的TNF-α及IFN-γ，Th17細(xì)胞分泌的IL-17，介導(dǎo)主要的炎癥反應(yīng)。現(xiàn)今臨床上葡萄膜炎的常規(guī)治療藥物多使用非甾體抗炎藥和類固醇激素，如前列腺素、阿司匹林等。另熱敷，超短波理療或結(jié)合手術(shù)治療相關(guān)并發(fā)癥。而上述治療藥物的缺陷也相當(dāng)明顯，很可能會(huì)引起其他器官甚至全身副反應(yīng)。為尋求新的治療方向和藥物，近來一些主要針對TNF-α、INF-γ、IL-17、IL-22、IL-23等炎性因子進(jìn)行的靶向治療的免疫調(diào)節(jié)型藥物在臨床上被逐漸重視[14]，它們效應(yīng)作用好，治療針對性強(qiáng)，與此同時(shí)副作用也明顯少于傳統(tǒng)藥物，因此具有很好的使用前景[15]。

圖4 免疫后第14天大鼠眼球組織IL-17和INF-γ mRNA的表達(dá)量

A：免疫后第14天大鼠眼球組織IL-17 mRNA的表達(dá)量；B：免疫后第14天大鼠眼球組織INF-γ mRNA的表達(dá)量；與正常組比較：**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1；與對照組比較：#P<0.05，##P<0.01

Mochizuki et al[16]發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性眼部炎癥性疾病中兩大類型的細(xì)胞數(shù)量大量增加，分別是Th1和Th17細(xì)胞。其中Th17細(xì)胞和IL-17在人葡萄膜炎和EAU動(dòng)物模型眼內(nèi)炎癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[17]，Th17細(xì)胞在急性葡萄膜炎或鞏膜炎期間增加，治療后減少。本研究中，為了證明MANF的抗炎作用，課題組測定了IL-17、INF-γ這兩種炎癥因子濃度。結(jié)果表明，MANF治療組于免疫后第14天抑制IL-17的產(chǎn)生，下調(diào)炎癥細(xì)胞Th1和Th17效應(yīng)反應(yīng)，減少炎癥因子IL-17、INF-γ的分泌，降低炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本研究證明，2 μg/μl的MANF玻璃體注射不僅可以抑制EAU的持續(xù)發(fā)生，還可以降低視網(wǎng)膜脫離、光感受器層的損傷和水腫以及白細(xì)胞浸潤和新生血管的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠眼內(nèi)的炎癥因子IL-17、INF-γ明顯被抑制，并且組織病理學(xué)結(jié)果同樣支持MANF對眼內(nèi)炎癥的改善作用，從而推斷MANF玻璃體腔注射可能是一種有效的抑制眼部炎癥的方法。本實(shí)驗(yàn)可初步推斷玻璃體腔注射MANF通過抑制致病性T細(xì)胞分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生來減輕眼部炎癥。然而，MANF抑制眼部炎癥的機(jī)制和對全身免疫反應(yīng)的影響尚不清楚，還需要進(jìn)一步探究。

綜上所述，玻璃體腔注射MANF可以通過抑制眼部組織炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而抑制大鼠EAU的持續(xù)發(fā)展，可能為葡萄膜炎的抗炎治療提供新途徑。