邸彥橙，王志龍，張智慧，宋 靜，高 強，吳 影，南錫浩，郭振海，田 河

腎結(jié)石是一種常見的泌尿系統(tǒng)疾病，多因晶體物質(zhì)在腎臟中異常聚積所致，其中以草酸鈣晶體最為常見[1]。草酸在腎臟中的積累可誘導(dǎo)腎臟損傷，產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，進一步損傷腎小管上皮細胞，促使草酸鈣晶體更易黏附于腎小管上皮細胞表面，對草酸鈣結(jié)石的形成具有促進作用[2-3]。而Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH associated protein 1，Keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/血紅素氧合酶 1(heme oxygenase 1，HO-1)是細胞內(nèi)最為重要的一條內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激途徑。大量研究[4-5]顯示，激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路可顯著降低機體內(nèi)ROS水平，并對維持機體內(nèi)氧化/抗氧化平衡起著重要作用。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種多酚類化合物，常見于花生、葡萄、虎杖等植物中，具有多重生物學活性。多項研究[6-7]表明，白藜蘆醇可激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路，發(fā)揮抗氧化作用。該研究擬采用1%乙二醇+2%氯化銨誘導(dǎo)法制備大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型，初步探討Res對草酸鈣結(jié)石形成的影響以及與Keap1-Nrf2/HO-1信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量240～260 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SYXK(湘)2014-0012。大鼠飼養(yǎng)于相對濕度50%～60%，溫度(22±2)℃，通風良好的環(huán)境中，自由飲食。

1.2 主要試劑與儀器白藜蘆醇，純度≥98%，購自甘肅益生祥生物技術(shù)有限公司；Nrf2抑制劑ML385購自美國MedChemExpress公司；丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；ROS測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；細胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒、HRP標記的山羊抗兔IgG均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗人Keap1單克隆抗體、兔抗人HO-1單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；Von Kossa染色試劑盒、兔抗人Nrf2多克隆抗體、兔抗人Histone H3多克隆抗體均購自英國Abcam公司；全自動生化分析儀購自美國Beckman Coulter公司；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1動物造模與分組處理 60只雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分成5組，即對照組、模型組、Res低劑量組(L-Res組)、Res高劑量組(H-Res組)和Res高劑量聯(lián)合Nrf2抑制劑ML385組(H-Res + ML385組)，每組12只。除了對照組，其他各組均參考文獻[8]采用1%乙二醇+2%氯化銨誘導(dǎo)法制備大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型，具體為采用1%乙二醇兌水用于自由飲水，2%氯化銨用于灌胃，每次1 ml，每日2次，連續(xù)造模4周。造模的同時進行給藥處理，對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，L-Res組給予40 mg/(kg·d)Res灌胃，H-Res組給予160 mg/(kg·d)Res灌胃，H-Res+ML385組在H-Res組的基礎(chǔ)上給予30 mg/kg ML385腹腔注射，2 d/次，連續(xù)給藥4周。

1.3.2尿液、血液相關(guān)指標檢測 實驗結(jié)束前1 d，使用代謝籠收集所有大鼠24 h空腹尿液，采用量筒測定24 h排尿量，以精密pH計測定尿液pH值，全自動生化分析儀檢測尿液中Ca2+濃度，采用鉻酸鉀氧化甲基紅催化光度法測定尿草酸(Ox)含量。實驗結(jié)束前采集各組大鼠空腹靜脈血，采用全自動生化分析儀檢測血清中尿氮素(BUN)、肌酐(Cr)、Ca2+含量。

1.3.3Von Kossa染色觀察大鼠腎臟組織草酸鈣晶體形成 實驗結(jié)束后斷頸處死各組大鼠，取左腎石蠟包埋切片后，65 ℃恒溫烘干，經(jīng)二甲苯、梯度濃度乙醇脫水，滴加1%硝酸銀溶液，在紫外線照射下孵育30 min，蒸餾水洗滌3次，滴加5%硫代硫酸鈉孵育3 min，蒸餾水洗滌3次，置于核固紅染液中孵育3 min，流水沖洗2 min，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.3.4大鼠腎臟組織中MDA含量與SOD活性檢測 取約0.1 g右腎組織，加入1 ml蛋白抽提液，冰浴條件下碾碎，12 000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒操作說明書加入相應(yīng)試劑，孵育后測各樣品吸光度值，根據(jù)試劑盒操作說明書提供的計算公式分別計算MDA含量和SOD活性。

1.3.5大鼠腎臟組織中ROS水平檢測 取約1 mm3右腎組織，在預(yù)冷的PBS中漂洗，加入適量胰酶消化液，37 ℃消化30 min，間斷性吹打已消化組織，用預(yù)冷PBS終止消化，采用300目尼龍網(wǎng)過濾，收集細胞，500 r/min離心10 min，棄上清液，重懸細胞，加入10 μmol/L 熒光探針2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀上機檢測，記錄每組熒光強度值(fluorescence intensity，F(xiàn)I)，結(jié)果以相對于對照組熒光強度值表示。

1.3.6Western blot檢測大鼠腎臟組織中Keap1、Nrf2和HO-1等蛋白表達 取右腎組織，加入適量RIPA裂解液，冰上碾磨組織，12 000 r/min離心10 min，取上清液即為組織總蛋白溶液。另取部分右腎組織，根據(jù)核蛋白提取試劑盒說明書操作步驟提取腎臟組織細胞核蛋白，均采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。均取20 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，對于總蛋白檢測分別加入兔抗人Keap1單克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗人HO-1單克隆抗體(1 ∶1 000)和兔抗人GAPDH單克隆抗體(1 ∶1 000)；對于核蛋白檢測分別加入兔抗人Nrf2多克隆抗體(1 ∶500)、兔抗人Histone H3多克隆抗體(1 ∶1 000)，均4 ℃孵育過夜。洗滌后加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光液孵育1 min后，使用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照觀察。目的蛋白相對表達量以目的蛋白光密度值與內(nèi)參蛋白光密度值的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 Res對草酸鈣腎結(jié)石模型大鼠尿液指標的影響與對照組比較，模型組大鼠24 h尿量、尿pH值降低，而24 h尿Ox含量和尿Ca2+含量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，L-Res組和H-Res組大鼠24 h尿量和尿pH值增加，而24 h尿Ox含量和尿Ca2+含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且H-Res組優(yōu)于L-Res組。H-Res+ML385組與模型組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 Res對草酸鈣腎結(jié)石模型大鼠血清生化指標的影響與對照組比較，模型組大鼠血清BUN、Cr和血Ca2+含量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，L-Res組和H-Res組大鼠血清BUN、Cr和血Ca2+含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且H-Res組各指標下降幅度均優(yōu)于L-Res組。H-Res+ ML385組大鼠血清BUN、Cr和血Ca2+含量與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表1 各組大鼠24 h尿量及尿液生化指標比較

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

圖1 各組大鼠腎臟組織Von Kossa染色 ×40

表2 各組大鼠血清生化指標比較

與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.3 Res對草酸鈣腎結(jié)石模型大鼠腎臟草酸鈣結(jié)晶形成的影響Von Kossa染色后草酸鈣晶體呈現(xiàn)黑色著色，如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中黑色著色增多；與模型組比較，隨著Res給藥濃度的增加，L-Res組和H-Res組大鼠腎臟組織中黑色著色減少；H-Res+ ML385組與模型組比較依舊可見大鼠腎臟中存在較多的黑色著色。

2.4 Res對草酸鈣腎結(jié)石模型大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激水平的影響與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中ROS水平、MDA含量增加，SOD活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，L-Res組和H-Res組大鼠腎臟組織中ROS水平、MDA含量降低，SOD活性增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且H-Res組優(yōu)于L-Res組。H-Res+ML385組與模型組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 各組大鼠腎臟組織SOD活性、MDA含量

與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.5 Res對草酸鈣腎結(jié)石模型大鼠Keap1-Nrf2/HO-1信號通路的影響與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織中核蛋白Nrf2及全蛋白Keap1、HO-1表達減少；與模型組比較，L-Res組和H-Res組大鼠腎臟組織中核蛋白Nrf2及全蛋白Keap1、HO-1則又呈濃度依賴式上調(diào)，而H-Res+ML385組與模型組比較各蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

3 討論

導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)結(jié)石形成的病因可大致歸納為四個主要因素，即遺傳因素、代謝因素、飲食因素和局部因素。而有關(guān)該疾病的發(fā)病機制目前還尚無定論，但從結(jié)石成分分析來看，以草酸鈣為主要成分的結(jié)石占比最高，且其復(fù)發(fā)率也保持較高水平[9-10]。在草酸鈣結(jié)石形成初期，高濃度草酸會刺激腎小管上皮細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的氧自由基，后者可改變細胞膜磷脂選擇性，促進膜表面草酸鈣晶體附著及成核，形成結(jié)石[11]。此外，形成的結(jié)石可進一步損傷腎小管上皮細胞，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而形成惡性循環(huán)。同時，Ma et al[3]也證實，在腎結(jié)石患者體內(nèi)存在較高的氧化應(yīng)激水平。因此，抗氧化療法或許能夠為腎結(jié)石的預(yù)防和治療提供新的思路。

圖2 Western blot檢測各組大鼠腎臟組織Nrf2、Keap1和HO-1蛋白的表達

A：Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達；B：蛋白相對表達量；1：對照組；2：模型組；3：L-Res組；4：H-Res組；5：H-Res+ML385組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01，###P<0.001

目前，1%乙二醇+2%氯化銨誘導(dǎo)法是制備腎草酸鈣結(jié)石動物模型的常用方法。乙二醇是草酸的前體物質(zhì)，在體內(nèi)可代謝成草酸，引起高草酸尿癥，造成腎小管上皮細胞發(fā)生損傷，導(dǎo)致腎結(jié)石。而氯化銨可酸化尿液，促進草酸鈣晶體的析出，加快腎結(jié)石的形成[12]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，造模后模型組大鼠尿pH值和24 h尿量均降低，而尿草酸含量、血清BUN和Cr以及尿Ca2+、血Ca2+含量均顯著升高，并且腎臟組織中存在大量草酸鈣晶體析出。說明腎草酸鈣結(jié)石模型制備成功。而采用Res干預(yù)后，與模型組比較，Res組大鼠尿pH值和24 h尿量均升高，而尿草酸含量、血清BUN和Cr以及尿Ca2+、血Ca2+含量均顯著降低，且大鼠腎臟組織中草酸鈣晶體析出量減少。說明Res干預(yù)可抑制腎草酸鈣結(jié)石的形成。

Res具有天然的強抗氧化能力，不僅能夠抑制氧自由基的產(chǎn)生，還能夠清除氧自由基以及抑制脂質(zhì)過氧化，對多種病理狀態(tài)下的氧化應(yīng)激水平均有改善作用[13],提示Res抑制腎草酸鈣結(jié)石形成的機制可能與其抗氧化作用有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎臟組織中ROS水平和MDA含量顯著增加，SOD活性顯著降低。說明草酸鈣結(jié)石模型大鼠腎臟組織確實存在較高的氧化應(yīng)激水平。而Res干預(yù)后可顯著降低大鼠腎臟組織中ROS水平和MDA含量，并顯著提高SOD活性。說明Res可降低大鼠腎臟組織內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，但在腎草酸鈣結(jié)石形成過程中Res通過何種途徑發(fā)揮抗氧化作用目前還未知。

Keap1-Nrf2/HO-1信號通路是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的機體抵抗外界氧化刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。正常情況下，Nrf2與細胞骨架相關(guān)蛋白Keap1結(jié)合以二聚體的形式存在于細胞漿中，當受到外界氧化應(yīng)激因子刺激后，Nrf2與Keap1解離并轉(zhuǎn)位進入細胞核，然后通過與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件AR相互作用，誘導(dǎo)抗氧化蛋白(如HO-1)等蛋白的表達，進而發(fā)揮抗氧化作用[14]。已證實，Res可激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮抗氧化作用[6-7]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎臟組織中細胞核中Nrf2蛋白及全蛋白Keap1、HO-1表達減少，采用Res干預(yù)后核蛋白Nrf2及全蛋白Keap1、HO-1又顯著上調(diào)。然而，采用ML385阻斷Keap1-Nrf2/HO-1信號通路傳導(dǎo)后，Res干預(yù)效果則被顯著抑制，表明Res可能是通過激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路介導(dǎo)的抗氧化作用抑制草酸鈣結(jié)石的形成。