王增夏，解金紅，王 賀，趙亞楠，曹英杰，關懷敏

心房顫動(房顫)是臨床上最常見的心律失常之一，房顫可導致心房內(nèi)血栓及腦卒中等多種并發(fā)癥，嚴重影響生活質(zhì)量，并且會給患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔[1]。房顫發(fā)病機制尚不完全清楚，電重構(gòu)、氧化應激在房顫的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[2]，L型鈣通道(L-type calcium channel, ICa-L)[3]是心臟電活動中的重要離子通道之一，是構(gòu)成動作電位二期平臺期的重要離子流。胺碘酮是經(jīng)典的Ⅲ類抗心律失常藥物，對多種離子通道，如鈉通道、鉀通道、鈣通道均有阻滯作用。該研究在于明確H2O2介導的氧化應激及胺碘酮對大鼠心房肌細胞L型鈣通道電流(L-type calcium channel current,ICaL)的影響，為闡明房顫機制提供細胞分子水平的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與溶液、試劑動物選取清潔級成年雄性SD大鼠由鄭州大學實驗動物中心提供，體質(zhì)量280～320 g，動物實驗方法通過我國動物倫理學的規(guī)定。胺碘酮、10 mol/L H2O2、TEA-Cl、二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司；膠原酶Ⅱ購于美國Gibco公司；NaH2PO4、HEPES、L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)、?；撬?Taurine)、EGTA、Mg-ATP、CsCl購于北京索萊寶科技有限公司；CaCl2購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

無鈣臺式液成分：NaCl 136 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、NaH2PO4·2H2O 0.33 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，用NaOH將pH值調(diào)至7.4。

KB液成分：KOH 80 mmol/L 、KCl 30 mmol/L、L-Glutamic Acid 50 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、KH2PO420 mmol/L、Taurine 20 mmol/L、EGTA 0.5 mmol/L，用KOH將pH值調(diào)至7.4。

酶液：20 mgⅡ型膠原酶、10 μl 0.1 mol/L CaCl2加入到無鈣臺式液中，定容至50 ml。

記錄ICaL的細胞內(nèi)液成分：CsCl 130 mmol/L、MgCl2·6H2O 2 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、EGTA 15 mmol/L、Mg-ATP 3 mmol/L、Glucose 10 mmol/L，用CsOH將pH值調(diào)至7.2。

記錄ICaL的細胞外液成分：TEA-Cl 136 mmol/L、CaCl22 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucose 10 mmol/L，用CsOH將pH值調(diào)至7.4。

1.2 成年SD大鼠單個心房肌細胞的分離采用酶解法分離并制備單個心房肌細胞[4]。提前將無鈣臺式液、KB液、酶液100%充氧30 min。SD大鼠腹腔注射肝素(200 IU/ml)0.3 ml后，10%水合氯醛(0.30 mg/kg)腹腔注射麻醉。SD大鼠麻醉后，開胸，迅速取出心臟，置于冰無鈣臺式液的培養(yǎng)皿里，用無齒眼科鑷夾住主動脈上緣，逆行插管至主動脈根部，使插管的下緣于肺動脈的起始部在同一水平面上。使用Langendorff恒流灌流裝置[5]，灌流速度5.4 ml/min，在恒溫狀態(tài)下(溫度保持在37.5 ℃)，首先用無鈣臺式液灌流2～3 min，待心臟內(nèi)血液沖洗干凈后，換用酶液灌流，待無鈣臺式液沖洗干凈約2 min后，結(jié)扎上下腔靜脈、肺靜脈，繼續(xù)酶液灌流9～10 min，用眼科鑷輕輕牽拉心房肌，心房肌組織變得松軟，輕輕牽拉沒有阻力時，沿房室間溝將左右心房剪掉，放入KB液中，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm的小組織塊，用吸管輕輕吹打約3～5 min，可以看到組織塊拉成絲狀，分離出單個心房肌細胞，用200目的細胞篩網(wǎng)過濾此KB液，過濾后的細胞懸液用小燒杯定容至10 ml，為細胞復鈣做準備。用含有對應CaCl2濃度的KB液，分次逐步加入到10 ml細胞懸液中，使其恢復至生理濃度，具體復鈣方法如下：10 ml細胞懸液，第1次2 ml KB液+12 μl 0.1 mol/L CaCl2反復吹打混勻后緩慢加到細胞懸液中；每間隔5 min，用同樣方法分別加入16、35、79、94 μl 0.1 mol/L CaCl2于2 ml KB液中，混勻后加入細胞懸液中。復鈣結(jié)束后在細胞培養(yǎng)板中用心肌細胞培養(yǎng)液鋪板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育，以備后續(xù)膜片鉗實驗使用。

1.3 藥物配制胺碘酮單體用DMSO溶解(DMSO的終濃度不超過0.1%)，加超純水制備成母液，敷藥時稀釋成5 μmol/L的工作液。10 μmol/L H2O2敷藥時稀釋成100 μmol/L工作液[6]。

1.4 心房肌細胞的處理和藥物的使用細胞共分為3組：① 對照組：細胞不經(jīng)過處理直接進行膜片鉗實驗，記錄鈣電流(n=15)；② H2O2組：細胞經(jīng)100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)0.5 h后進行膜片鉗實驗并記錄電流(n=15)；③胺碘酮組：細胞預先經(jīng)100 μmol/L H2O2培養(yǎng)0.5 h后加入5 μmol/L胺碘酮培養(yǎng)0.5 h進行膜片鉗實驗并記錄電流(n=18)。

1.5 排除電流干擾為了確保記錄到的鈣電流是純凈鈣電流，在電極內(nèi)液和細胞外液里均不含有Na+，故排除了Na+電流干擾，并且在上述兩種液體里分別加入CsCl、TEA-Cl故排除了K+電流干擾。心房肌細胞膜分布了兩種鈣通道，分別為ICa-L和T型鈣通道，該實驗將電壓鉗制在-40 mV，以致T型鈣通道失活，綜上，記錄到的鈣電流是ICaL。

1.6 膜片鉗全細胞記錄使用全細胞膜片鉗技術[7]，在電壓鉗制下記錄ICaL。將HEKA EPC-10放大器(德國HEKA公司)與計算機相連接。電壓輸入信號和刺激信號的采集均有軟件PatchMaster控制。玻璃電極(美國Sutter公司)經(jīng)P-97微電極拉制儀(美國Sutter公司)拉制成電阻為2.0～5.0 MΩ的電極[8]。在顯微鏡下挑選外觀完整規(guī)則，邊界清晰，表面光滑無顆粒，立體感強，橫紋清楚，不收縮的梭型細胞。將玻璃電極充灌好電極內(nèi)液，在玻璃電極插入浴液前，給予輕微的正壓，用三維操縱儀(MP-225，Sutter公司)調(diào)節(jié)玻璃電極的位置使其入液，入液后進行液接電位補償，繼續(xù)調(diào)節(jié)電極尖端的位置使其接觸到細胞表面，輕壓細胞，撤除正壓，在電極尖端施加小的負壓，形成高阻封接，待封接電阻達到2 GΩ以上，進行電極電容補償，繼續(xù)負壓吸引使其破膜形成全細胞記錄模式，并對全細胞膜電容進行補償。信號經(jīng)截止頻率為1 kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣頻率為10 kHz。

1.7 ICaL刺激參數(shù)ICa-L的I-V曲線：鉗制電位-70 mV，給予250 ms，階躍10 mV，-60 mV～+60 mV的系列刺激，用每個細胞的膜電容(Cm)求電流密度(pA/pF)，用電流密度與相應測試電壓作圖，得I-V曲線。ICa-L失活曲線刺激程序：鉗制電位-70 mV，給予1 000 ms，階躍10 mV，-60 mV～+40 mV的系列脈沖，每一條件脈沖后再緊跟+10 mV、250 ms的測試脈沖。階躍電壓下相應電流標準化后用Boltzmann方程擬合出失活曲線。ICa-L失活后恢復曲線刺激程序：鉗制電位-70 mV，給予+10 mV、250 ms的刺激，間隔8、12、18、26、39、58、87、130、195、293、439、658、986、1 479 ms后，再給予+10 mV、250 ms的刺激，記錄相應電流除以完全恢復后的最大電流與相應的恢復時間作圖得出恢復曲線,用單指數(shù)方程擬合[9]。見圖1。

圖1 ICa-L的刺激程序

圖2 SD大鼠心房肌細胞ICaL的驗證

A：空白組和維拉帕米組(100 μmol/L)去極化到0 mV時的原始電流圖；B：空白組和維拉帕米組電流密度直方圖；與空白組比較：*P<0.05

圖3 各組原始電流圖、直方圖及I-V曲線圖

1.8 統(tǒng)計學處理使用Igor、Origin軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示，組間比較采用單因素方差分析，Leven檢驗方差齊性，P<0.05時，組間比較采用Dunnett's T3法；反之采用LSD-t法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ICaL的驗證SD大鼠心房肌細胞ICaL是通過穩(wěn)態(tài)激活刺激程序刺激記錄出來的，維拉帕米是ICaL的阻斷劑，維拉帕米100 μmol/L幾乎可以完全阻斷該電流，從而確定此電流是ICaL。見圖2。

2.2 各組大鼠心房肌細胞ICaL密度的比較單因素方差分析F=23.32，P<0.000 1，按α=0.05檢驗水準，可認為各組總體均數(shù)總的有差別；組間的多重比較結(jié)果如下：與空白組比較，H2O2組ICaL密度升高[(-4.99±0.35) pA/pFvs(-6.97±0.60) pA/pF，P<0.05]，H2O2可以使ICaL增加；與H2O2組比較，胺碘酮組ICa-L密度降低[(-6.97±0.60) pA/pFvs(-3.16±0.20) pA/pF，P<0.05]，胺碘酮使ICaL降低。見圖3B。

2.3 各組大鼠心房肌細胞ICa-LI-V曲線變化的比較與空白組比較，H2O2組細胞在各電壓下電流密度均增大,胺碘酮組細胞在各電壓下電流密度均減小。說明胺碘酮對ICaL有抑制作用。見圖3C。

2.4 各組大鼠心房肌細胞ICa-L穩(wěn)態(tài)激活曲線變化的比較與空白組比較，H2O2組ICa-L穩(wěn)態(tài)激活曲線左移，半激活電壓V1/2從(-11.92±0.68) mV移動到(-14.48±0.65) mV，P<0.05；與H2O2組比較，胺碘酮組ICa-L穩(wěn)態(tài)激活曲線向左移動，半激活電壓V1/2從(-14.48±0.65) mV移動到(-16.74±0.70) mV，P<0.05。H2O2、胺碘酮均可以使ICa-L激活加快。見圖4。

圖4 各組ICa-L的穩(wěn)態(tài)激活曲線圖

圖5 各組ICa-L的穩(wěn)態(tài)失活曲線圖

A：空白組、H2O2組和胺碘酮組通道失活50%時條件脈沖電壓下失活曲線的原始電流圖；B：空白組、H2O2組和胺碘酮組失活曲線

圖6 各組恢復曲線原始圖及ICa-L的失活后恢復曲線圖

A：空白組恢復曲線的部分原始電流圖；B：H2O2組恢復曲線的部分原始電流圖；C：胺碘酮組恢復曲線的部分原始電流圖；D：空白組、H2O2組和胺碘酮組失活后恢復曲線圖

2.5 各組大鼠心房肌細胞ICa-L穩(wěn)態(tài)失活曲線變化的比較與空白組比較，H2O2組ICa-L穩(wěn)態(tài)失活曲線變化不明顯，半失活電壓V1/2從(-29.42±0.49) mV移動到(-29.12±0.76) mV，P>0.05，說明H2O2對ICa-L的失活影響不大；與H2O2組比較，胺碘酮組ICa-L穩(wěn)態(tài)失活曲線明顯向左移動，半失活電壓V1/2從(-29.12±0.76) mV移動到(-42.19±0.65) mV，P<0.05，胺碘酮可以使ICaL失活加快。見圖5。

2.6 各組大鼠心房肌細胞ICa-L失活后恢復曲線變化的比較與空白組比較，H2O2組失活后恢復曲線左移，ICa-L恢復時間常數(shù)Tau值從(215.0±19.76) ms減少至(164.9±11.51) ms，P>0.05，H2O2對ICa-L的恢復影響差異無統(tǒng)計學意義；與H2O2組比較，胺碘酮組恢復曲線明顯右移，ICa-L恢復曲線的時間常數(shù)從(164.9±11.51) ms增加至(1 199±42.67) ms，P<0.05，胺碘酮使ICa-L的恢復時間延長，恢復變慢。見圖6。

3 討論

氧化應激在心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮了重要的作用[10]，H2O2可能與缺血、炎癥、心力衰竭的病理過程有關，炎癥、缺血、心力衰竭與房顫的發(fā)生也有關系。氧化應激不僅導致心房重構(gòu)，也會引起心房電生理的改變。通過用H2O2對心房肌細胞進行干預，建立氧化應激模型，采用臨床上典型的Ⅲ類抗心律失常藥物胺碘酮對建立的氧化應激模型的心房肌細胞進行干預，觀察其對心房肌細胞電流的影響，從而進一步研究胺碘酮對心房肌細胞ICa-L活性的影響以及其抗心律失常的作用機制。全細胞膜片鉗技術能直接觀察細胞膜的離子通道電流，是研究抗心律失常藥物作用靶點的重要手段。ICa-L是心肌細胞膜上鈣離子內(nèi)流的重要通道，其在心房電重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。本實驗中，H2O2使ICaL變大，胺碘酮使ICaL變小，胺碘酮對通道的激活、失活、恢復動力學特性均有影響。胺碘酮可以影響鈣通道電流從而逆轉(zhuǎn)心房肌細胞的電重構(gòu)[11]，房顫患者口服胺碘酮后不僅可以有效阻止重構(gòu)的發(fā)生，還可逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的重構(gòu)。因此，胺碘酮發(fā)揮抗房顫作用很可能是通過影響心房肌細胞電重構(gòu)實現(xiàn)的。胺碘酮的臨床價值受到副作用的限制。阻止重構(gòu)發(fā)生在胺碘酮抗房顫特性中具有潛在的重要價值，這可能為開發(fā)通過預防房顫相關重構(gòu)而對抗房顫的新型化合物提供一個有用的范例。