周君陽(yáng)，于 莉，陳秀英，成 健，羅心霞，王 玨，黃寬明，朱名安，丁 妍

宮頸癌在女性中高發(fā)，是常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康[1]。早期研究認(rèn)為人類乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染是宮頸癌的主要致病因素之一，近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明，宮頸癌細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的改變是影響其發(fā)生及演進(jìn)的重要因素[2]。

TET1作為體內(nèi)一種加氧酶，具有高效催化5-甲基胞嘧啶(5-mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)的作用[3]。TET1在多種惡性腫瘤組織中低表達(dá)，如前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌，具有明顯的去甲基化作用[4]。研究[5]表明，TET1的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且TET1表達(dá)水平的下調(diào)可以活化致癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。該研究擬通過(guò)構(gòu)建TET1過(guò)表達(dá)HeLa細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞增殖試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、Transwell試驗(yàn)檢測(cè)其增殖、侵襲、遷移等能力的變化，探究TET1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒 p57TALE-VP64過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)于上海泰冷生物技術(shù)有限公司。

1.1.2細(xì)胞 選用人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞系(胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.1.3主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco，11965-092)、胎牛血清(美國(guó)，Gibco公司，10099-141)；Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Thermo Fisher公司，L3000001)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司，3422)；TET1抗體(美國(guó)Aviva Systems Biology公司，OAAB19195)；小鼠抗人GAPDH抗體(AF0006)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)、四唑鹽 (thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、BeyoECL Star (特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，P0018AS，上海碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基配制：90% DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)。

1.2.2TET1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子(transcription activator-like effectors, TALE)設(shè)計(jì)原則，選取TET1啟動(dòng)子區(qū)不同區(qū)域設(shè)計(jì)6條TALE臂，根據(jù)TALE臂堿基序列，將相應(yīng)的模塊與骨架載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后挑取菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，選出序列正確的質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種至6孔板內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105/ml，培養(yǎng)過(guò)夜。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取2支滅菌的1.5 ml離心管，1管加入TALE-VP64-TET1質(zhì)粒2 μg，優(yōu)化培養(yǎng)基(opti-minima essential medium, Opti-MEM) 50 μl，輕輕吹打混勻；另1管加入2 μl Lipo-fectamine 3000和50 μl Opti-MEM培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，室溫孵育5 min。將兩管液體混合，室溫下溫育5 min，最后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴加到待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染24 h后，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株，待細(xì)胞長(zhǎng)到一定密度后檢測(cè)過(guò)表達(dá)效率。

1.2.4細(xì)胞增殖試驗(yàn) 取野生型和過(guò)表達(dá)型HeLa細(xì)胞，接種至96孔板內(nèi)，每孔200 μl完全培養(yǎng)基，細(xì)胞密度1×104/ml，每組5個(gè)重復(fù)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于培養(yǎng)第1、3、5、7天進(jìn)行MTT檢測(cè)。

1.2.5劃痕試驗(yàn) 取野生型和過(guò)表達(dá)型HeLa細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至0.5×106/ml，接種至12孔板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。劃痕前1天晚上將培養(yǎng)液換為DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。次日用小槍頭在培養(yǎng)皿底劃出水平劃痕，用PBS洗去多余的細(xì)胞，繼續(xù)用DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。分別在劃后0、24、48 h拍照記錄。

1.2.6Transwell試驗(yàn) 將DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和Matrigel膠按5 ∶1的比例稀釋，以50 μl/孔的濃度均勻鋪在Transwell小室上室內(nèi)，37 ℃靜置2 h，使Matrigel膠凝固。取不同TET1基因型HeLa細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度到1×106/ml。向上室加入100 μl/孔細(xì)胞懸液，下室內(nèi)每孔加入500 μl/孔DMEM完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后取出小室，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS充分水洗，1%結(jié)晶紫染液室溫染色15 min，PBS充分水洗，擦去上室中的Matrigel膠及細(xì)胞，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7Western blot 提取不同組別HeLa細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳。15 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(TET1，稀釋度1 ∶500；GAPDH，稀釋度1 ∶1 000)，4 ℃搖床過(guò)夜，洗滌緩沖液 (tris buffered saline tween, TBST) 洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜后顯影。

2 結(jié)果

2.1 TET1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定因?yàn)門ET1的 CDS序列比較長(zhǎng)，常規(guī)的克隆方法存在困難，采用TALE特異性識(shí)別并結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子，再與VP64增強(qiáng)子結(jié)合，從而增強(qiáng)靶基因的表達(dá)(圖1A)。本研究中，針對(duì)TET1啟動(dòng)子區(qū)域，共選擇了6個(gè)靶位點(diǎn)。將構(gòu)建成功并測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)效率檢測(cè)最終確定2號(hào)(TALE靶序列為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-231至-216)質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將2號(hào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，嘌呤霉素篩選10 d，最后采用反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng) (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)及Western blot檢測(cè)TET1過(guò)表達(dá)效率，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)克隆(Clone 1、Clone 2)穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)TET1(圖1B)，并將這2個(gè)克隆用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 TET1過(guò)表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖能力的影響為了檢測(cè)TET1過(guò)表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖能力的影響，本研究采用MTT檢測(cè)HeLa細(xì)胞增殖狀況。連續(xù)監(jiān)測(cè)7 d后，得到3組細(xì)胞的增殖曲線(圖2)，TET1過(guò)表達(dá)的Clone 1和Clone 2細(xì)胞增殖能力明顯弱于野生型HeLa細(xì)胞(tday 5=2.6,tday 7=3.03,P<0.05)。

2.3 TET1過(guò)表達(dá)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響對(duì)過(guò)表達(dá)TET1的HeLa細(xì)胞，采用Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)其侵襲能力的變化情況。如圖3所示，Transwell小室培養(yǎng)48 h后， Clone 1及Clone 2穿過(guò)magtrigel膠及小室的細(xì)胞分別是(21±5)和(22±6)個(gè)/視野，而野生型細(xì)胞組為(38±7)個(gè)/視野，與野生型細(xì)胞組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，t值分別為4.42和3.88)。 結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TET1明顯降低了HeLa細(xì)胞的侵襲能力。

圖1 TET1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定

A： TET1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；B: RT-PCR及Western blot檢測(cè)TET1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒鑒定；Clone 1和Clone 2：分別為TET1過(guò)表達(dá)HeLa細(xì)胞克隆1和克隆2；Wild：野生型HeLa細(xì)胞

圖2 TET1過(guò)表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖能力的影響

圖3 TET1過(guò)表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響

A： TET1過(guò)表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響 ×10；B: 柱狀圖分析不同組別遷移的細(xì)胞數(shù)；與Wild細(xì)胞比較：*P<0.05

2.4 TET1過(guò)表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響劃痕試驗(yàn)是判斷細(xì)胞遷移能力的經(jīng)典試驗(yàn)。本研究采用劃痕試驗(yàn)檢測(cè)TET1過(guò)表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果表明，TET1過(guò)表達(dá)組(Clone 1、Clone 2)細(xì)胞24 h及48 h的遷移率分別為(17.48±3.12)%、(18.23±3.57)%及(51.68±6.35)%、(53.25±7.16)%，而野生型HeLa組細(xì)胞24 h及48 h的遷移率分別為(29.68±4.63)%及(75.83±8.42)%，后者明顯高于前者(P<0.01, 24 ht值分別為2.75、2.68, 48 ht值分別為4.25、3.78)，見圖4。

圖4 TET1過(guò)表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響

A： 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)24 h及48 h遷移狀況圖 ×10；B:不同組HeLa細(xì)胞24 h及48 h遷移率柱狀統(tǒng)計(jì)圖；與Wild細(xì)胞比較：**P<0.01

3 討論

TET1是TET家族最重要的成員之一，屬于含有α-酮戊二酸及Fe2+的雙加氧酶[6]。TET1能夠催化5-mC轉(zhuǎn)化為5-hmC，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶，從而實(shí)現(xiàn)DNA去甲基化，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[7]。許多腫瘤中存在自噬相關(guān)調(diào)節(jié)基因的甲基化異?，F(xiàn)象，TET1作為一種新的去甲基化轉(zhuǎn)錄因子，在多種疾病具有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)TET1具有抑癌作用[8]，在肺癌[9]、結(jié)腸癌[10]、乳腺癌[11]組織中，TET1表達(dá)明顯減少。多項(xiàng)成瘤實(shí)驗(yàn)表明，如果TET1低水平表達(dá)，那么腫瘤細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，生長(zhǎng)速度加快，癌細(xì)胞更易轉(zhuǎn)移；若TET1過(guò)表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的侵襲性明顯降低，異種移植瘤的生長(zhǎng)受到抑制。最新的研究發(fā)現(xiàn)，TET1可以通過(guò)促進(jìn)Wnt通路拮抗劑腫瘤抑制因子β-連環(huán)蛋白抑制基因2和分泌型卷曲相關(guān)蛋白2的DNA去甲基化，抑制Wnt/catenin信號(hào)通路，在鼻咽癌中發(fā)揮抗腫瘤能力[12]；還可以通過(guò)抑制分泌性蛋白Dikkopf-1及SFRP2從而抑制卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。綜上，TET1的低水平表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。對(duì)TET1與宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響的研究，必將對(duì)宮頸癌的早期診斷、預(yù)后及治療具有重要意義。

TALE是一種具有高度特異性的調(diào)節(jié)基因。由多個(gè)串聯(lián)的氨基酸重復(fù)序列構(gòu)成DNA結(jié)合域，一個(gè)重復(fù)序列通常可以識(shí)別一個(gè)特定堿基。根據(jù)靶基因特異的堿基序列，將相應(yīng)的功能模塊連接在一起，構(gòu)成識(shí)別該特異核酸序列的TALE蛋白分子。TALE蛋白分子具有很高的特異性，因?yàn)榧幢阌?個(gè)堿基錯(cuò)配，也不能被TALE識(shí)別。在分子生物學(xué)領(lǐng)域中，如果將特異的DNA結(jié)合域與蛋白的功能結(jié)構(gòu)域(比如核酸酶、增強(qiáng)子等)連接后導(dǎo)入細(xì)胞，就可以影響細(xì)胞相應(yīng)基因的表達(dá)[14]。

前期研究[15]表明，TET1基因敲除的宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖能力、侵襲能力增強(qiáng)，TET1基因敲除能增加宮頸癌HeLa細(xì)胞的惡性行為。為探討TET1基因過(guò)表達(dá)的HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究采用TALE-VP64系統(tǒng)構(gòu)建TET1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)染人HeLa細(xì)胞，得到了2個(gè)TET1過(guò)表達(dá)的單克隆HeLa細(xì)胞。分別用MTT法、Transwell侵襲試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)檢測(cè)不同組別HeLa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的變化情況。與野生型HeLa細(xì)胞相比，TET1基因過(guò)表達(dá)的HeLa細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力明顯降低。本研究表明TET1基因過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞有抑癌基因的作用，這一結(jié)果與TET1基因在其他腫瘤疾病中的作用類似，將為治療宮頸癌提供新的作用靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果與前期研究結(jié)果相互印證，證明了TET1基因?qū)eLa細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為具有重要的調(diào)控作用，為研究 TET1 的作用機(jī)制及宮頸癌的靶向治療提供了理論基礎(chǔ)，但具體的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。后續(xù)研究將會(huì)探討TET1基因調(diào)控宮頸癌惡性行為的具體機(jī)制，以期為臨床治療宮頸癌提供新的治療方案。