姚 遠(yuǎn)，汪國武，張 雨，劉 芳

宮腔黏連(intrauterine adhesion,IUA)是子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)障礙最常見的疾病，其本質(zhì)是子宮內(nèi)膜纖維化修復(fù)，確切的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確。近年研究證實(shí)，IUA的發(fā)生與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal，EMT)密切相關(guān)[1-2]。Thiery et al[3]提出2型EMT是大部分纖維化疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一。TGF-β1是誘導(dǎo)EMT的重要因子之一，廣泛用于體外誘導(dǎo)上皮細(xì)胞EMT[4-6]。項(xiàng)目組首次以兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞為研究對象，通過CCK-8、免疫組化、Western blot等方法探討TGF-β1誘導(dǎo)兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的條件，為研究IUA的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防及治療等提供一定的細(xì)胞基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物10～12周齡雌性新西蘭大白兔(體質(zhì)量2.5～3.0 kg，清潔級)60只，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，購回后自由進(jìn)食水適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器孕馬血清促性腺激素(PMSG)購自北京Solarbio公司；絨毛膜促性激素(hCG)購自寧波市三生藥業(yè)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、表皮生長因子、膠原酶I、0.25%胰蛋白酶購自美國Sigma公司；Human TGF-β1購自美國PEPROTECH公司；Rabbit Anti-Cytokeratin 19 antibody、Rabbit anti-Vimentin antibody、Rabbit Anti-E cadherin antibody購自北京Bioss公司；即用型SABC-POD試劑盒購自武漢博士德生物公司。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(HF151，上海力新儀器有限公司)；生物安全柜(BHC-1300ⅡA2，北京阿爾泰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；高端研究級倒置顯微鏡(Axio Observer A1，德國蔡司公司)；全光柵酶標(biāo)儀(Multiskan GO，美國莫賽飛世爾公司)；雙垂直電泳儀(DYCZ-24DN，北京六一儀器廠)。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)給予兔肌肉注射PMSG 100 IU，48 h后耳緣靜脈注射hCG 80 IU，18 h后耳緣靜脈空氣栓塞處死，取出子宮，含2%雙抗PBS洗3次，縱向剪開子宮，用手術(shù)刀片背面輕刮內(nèi)膜面至手感粗糙，DMEM/F12收集組織，用含0.05%膠原酶Ⅰ和0.05%胰蛋白酶的PBS重懸，37 ℃水浴鍋中消化30 min。含10%胎牛血清DMEM/F12終止消化，150 nm濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，濾液使用38 nm細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，濾網(wǎng)上為兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，濾網(wǎng)下為兔子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，DMEM/F12反復(fù)沖洗細(xì)胞篩，收集沖洗液1 200 r/min，離心6 min，棄上清液，使用上皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，以1×106個(gè)/ml接種，置于37 ℃，5%CO2，95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞免疫組化鑒定4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，0.3% Triton X-100浸泡5 min，蒸餾水洗2次，30% H2O2與純甲醇1 ∶50混合，室溫浸泡30 min，蒸餾水洗3次。5% BSA封閉，滴加一抗CK19(1 ∶200稀釋)、VIM(1 ∶200)、E-cadherin(1 ∶200)，37 ℃孵育1 h，加入二抗孵育37 ℃，30 min，PBS洗2次，加入SABC 37 ℃，30 min，DAB顯色2～10 min，蘇木精輕度復(fù)染25 s，1% HCl酒精洗滌7～8 s，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 CCK-8檢測將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種至96孔板中，待細(xì)胞融合至50%～60%，更換無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓處理12 h后更換上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，分別加入0、10、60、110 μg/L TGF-β1處理24 h和48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育3 h后酶標(biāo)儀測定450 nm下的OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。增殖抑制率(IR)%=[(OD值陰性對照組-OD值空白對照組)-(OD值實(shí)驗(yàn)組-OD值空白對照組)]/(OD值陰性對照組-OD值空白對照組)×100%。

1.6 Western blot檢測提取總蛋白，應(yīng)用BCA法檢測蛋白濃度，分別取等量的蛋白質(zhì)樣本，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，分別加入稀釋的一抗VIM(1 ∶200)、E-cadherin(1 ∶200)，4 ℃過夜。TBST洗3次，再將PVDF膜放入10 ml二抗稀釋液(1 ∶10 000)中，37 ℃溫箱避光孵育1 h，TBST洗3次。加ECL發(fā)光劑，X線曝光、顯影、定影。以GAPDH作為內(nèi)參，通過Image J對比蛋白灰度值進(jìn)行分析計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定細(xì)胞在培養(yǎng)3 d后開始貼壁，細(xì)胞貼壁后增殖速度緩慢，約生長14 d后鋪滿瓶底，細(xì)胞呈近圓形，胞漿飽滿，核位于細(xì)胞中央，排列緊密，呈鋪路石樣(圖1 A)。對其骨架蛋白進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞特異性細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)染色呈現(xiàn)陽性，細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色，核周胞質(zhì)染色最強(qiáng)(圖1 B)。

圖1 兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 ×200

A：P1代兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；B：P1代兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞CK-19染色

2.2 TGF-β1對兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖的影響TGF-β1處理24、48 h，隨著作用濃度增高，兔子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(F24 h=555.10，P<0.01；F48 h=17.00，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與10 μg/L TGF-β1處理組比較，60、110 μg/L處理24 h及48 h后細(xì)胞增殖均受到顯著抑制(P<0.05)，但60、110 μg/L濃度處理組間無顯著差異(P>0.05)。對不同時(shí)間點(diǎn)同一濃度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)60、110 μg/L濃度TGF-β1處理組48 h后對細(xì)胞的抑制率均顯著高于24 h(P<0.05)(表 1)。

表1 不同濃度TGF-β1對兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞細(xì)胞增殖抑制率

與10 μg/L組比較：*P<0.05；與同濃度24 h組比較：△P<0.05

2.3 TGF-β1對兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)的影響不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞24 h及48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化：結(jié)果如圖2所示：在不同濃度及不同時(shí)間點(diǎn)的TGF-β1誘導(dǎo)下，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞均呈不同程度的拉長或出現(xiàn)絲狀偽足，細(xì)胞拉長呈梭形，細(xì)胞邊界模糊，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞密度降低。其中60 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)24 h后，大多數(shù)細(xì)胞呈梭形(圖2C)，細(xì)胞形態(tài)較正常培養(yǎng)組相比發(fā)生了明顯的變化，向間質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化；110 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)48 h后，細(xì)胞呈典型的梭形，且細(xì)胞密度明顯降低(圖2H)。用不含TGF-β1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)上述細(xì)胞，觀察到細(xì)胞形態(tài)保持穩(wěn)定。

2.4 Western-blot法檢測E-cadherin和VIM蛋白表達(dá)結(jié)果顯示(圖3)：TGF-β1處理24、48 h，隨著作用濃度增高，E-cadherin蛋白相對表達(dá)量顯著降低(F24 h=15.89，P<0.01；F48 h=224.6，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；VIM蛋白相對表達(dá)量顯著升高(F24 h=27.77，P<0.01；F48 h=38.34，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組比較，10 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)24 h及48 h E-cadherin和VIM蛋白的表達(dá)均無顯著變化(P>0.05)；與對照組比較，60、110 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)24 h及48 h均顯著降低了E-cadherin蛋白表達(dá)量(P<0.05)，顯著提高了VIM蛋白的表達(dá)量(P<0.05)；60 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)48 h較24 h組E-cadherin蛋白和VIM蛋白的表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；110 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)48 h較24 h組VIM蛋白的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 免疫組化鑒定60 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)內(nèi)膜上皮細(xì)胞24 h免疫組化鑒定結(jié)果顯示：E-cadherin蛋白實(shí)驗(yàn)組較對照組陽性細(xì)胞較少(圖4A、4B)；VIM蛋白實(shí)驗(yàn)組較對照組陽性細(xì)胞較多(圖4C、4D)。使用Image J計(jì)算相對陽性細(xì)胞面積：TGF-β1實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白表達(dá)(95.94±2.662)顯著低于對照組(115.8±3.788),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組VIM蛋白表達(dá)量(132.4±4.638)顯著高于對照組(108.7±2.532),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 TGF-β1對兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)生物影響 ×100

A：正常培養(yǎng)24 h；B：10 μg/L TGF-β1劑量組誘導(dǎo)24 h；C：60 μg/L TGF-β1劑量組誘導(dǎo)24 h；D：110 μg/L TGF-β1劑量組誘導(dǎo) 24 h；E：正常培養(yǎng)48 h；F：10 μg/L TGF-β1劑量組誘導(dǎo)48 h；G：60 μg/L TGF-β1劑量組誘導(dǎo)48 h；H：110 μg/L TGF-β1劑量組誘導(dǎo) 48 h

圖3 不同濃度TGF-β1及不同作用時(shí)間誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞蛋白表達(dá)變化

A：24 h E-cadherin、VIM蛋白表達(dá)量；B：48 h E-cadherin、VIM蛋白表達(dá)量；C：E-cadherin蛋白相對表達(dá)量；D：VIM蛋白相對表達(dá)量；1：對照組；2：10 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)組；3：60 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)組；4：110 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)組；與對照組比較：*P<0.05；與同濃度24 h組比較：#P<0.05

圖4 TGF-β1誘導(dǎo)兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞24 h免疫組化 ×100

A：E-cadherim對照組；B：E-cadherim實(shí)驗(yàn)組；C：VIM對照組；D：VIM實(shí)驗(yàn)組

3 討論

EMT的發(fā)生取決于細(xì)胞從其微環(huán)境獲得信號，TGF-β1是一類涉及細(xì)胞增殖、凋亡、分化及EMT的調(diào)節(jié)因子[7]。在炎癥或損傷等病理因素作用下，TGF-β1趨化成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞聚集，同時(shí)促進(jìn)膠原蛋白和纖維蛋白的合成，致使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積和降解紊亂，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。研究顯示，IUA子宮內(nèi)膜及黏連組織[8]、血清[9]中TGF-β1表達(dá)較對照組均顯著升高，且TGF-β1的表達(dá)與宮腔黏連程度呈正相關(guān)[10]，提示TGF-β1參與子宮內(nèi)膜損傷纖維化修復(fù)，為TGF-β1誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮EMT提供了一定的理論基礎(chǔ)。

細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡是多數(shù)細(xì)胞的發(fā)育結(jié)局，其可因微環(huán)境不同而相互影響，細(xì)胞的分化、凋亡、衰老會導(dǎo)致其本身增殖抑制，本研究發(fā)現(xiàn)60 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞24 h即可抑制多數(shù)細(xì)胞增殖，促進(jìn)其轉(zhuǎn)分化。隨著TGF-β1濃度和作用時(shí)間增加，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EMT標(biāo)志物E-cadhrien表達(dá)顯著下調(diào)，表明TGF-β1是誘導(dǎo)EMT的有效因子。而VIM表達(dá)量呈增加趨勢，與前期課題小組研究子宮內(nèi)膜損傷后VIM蛋白表達(dá)增加結(jié)果一致[11]。綜上，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞通過TGF-β1誘導(dǎo)后，其形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，主動轉(zhuǎn)移潛能增加而細(xì)胞間黏附性降低，失去極性，發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化，成功誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。EMT與子宮內(nèi)膜纖維化疾病相關(guān)的研究很少見，直至近年才有學(xué)者陸續(xù)提出EMT可能是IUA的發(fā)病機(jī)制之一[2-3]，建立子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EMT模型或可為研究IUA發(fā)病機(jī)制及治療提供依據(jù)。

EMT是纖維化疾病中至關(guān)重要的過程，應(yīng)用EMT特異性抑制劑，阻礙EMT過程，已成為靶向治療纖維化疾病的新策略[12-13]，TGF-β1誘導(dǎo)兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EMT為研究宮腔黏連等子宮內(nèi)膜纖維化修復(fù)疾病的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防及治療提供了一定的細(xì)胞基礎(chǔ)。綜上所述，使用60 μg/L的TGF-β1誘導(dǎo)兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞24 h可成功建立EMT模型，但還需要進(jìn)一步研究建立子宮內(nèi)膜細(xì)胞EMT更加細(xì)致的條件及TGF-β1誘導(dǎo)兔子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EMT的具體機(jī)制。