陳曉彬，萬力生*，李佳曦，陳爭光

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041；2.深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518026）

支氣管哮喘（bronchial asthma）簡稱哮喘，是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。該病可發(fā)生于任何年齡，但以小兒較為常見，且是常見的兒科急癥之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)哮喘疾病患兒的治療費(fèi)用成為了各個國家衛(wèi)生部門支出中相當(dāng)龐大的一部分，該病對兒童的身心健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害。因此，哮喘疾病是關(guān)聯(lián)個體或者特殊群體而存在的問題，逐漸引起政府及衛(wèi)生事業(yè)研究者的高度重視的社會問題。

代謝組學(xué)是近年來一門新興的學(xué)科，以分析機(jī)體產(chǎn)生的小分子代謝產(chǎn)物（分子量＜1 000 Da），了解這些小分子物質(zhì)在某種疾病狀態(tài)下的終末變化過程，進(jìn)而揭示其在該疾病狀態(tài)下的動態(tài)過程及調(diào)控規(guī)律[3]。該學(xué)科更加強(qiáng)調(diào)應(yīng)用整體及動態(tài)的觀點(diǎn)來研究疾病，這與中醫(yī)學(xué)的整體、系統(tǒng)和辨證論治思維高度契合。在支氣管哮喘患者中，不同疾病階段其代謝終末產(chǎn)物可能存在一定差異。另外，該檢測手段具有更高的準(zhǔn)確性及靈敏度，并將統(tǒng)計(jì)學(xué)分析融入其中，通過一次檢測分析可找出多個可能與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物。因此，可將其作為該病的生物標(biāo)記物，動態(tài)的了解該病的發(fā)生、發(fā)展、嚴(yán)重程度評估、療效評價及預(yù)后。

中醫(yī)學(xué)辨證論治為中醫(yī)之根本，從中醫(yī)的角度出發(fā)，哮喘疾病的機(jī)制可從“風(fēng)邪”論、“痰”論、“痰瘀互結(jié)”論、“腑臟”論等多個方面進(jìn)行分析[4]。疾病的證型主要依靠患兒疾病的臨床表現(xiàn)，除外還需依靠醫(yī)者個人豐富的臨床診療經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行鑒別，中醫(yī)證型的分辨對小兒哮喘疾病的診療及機(jī)制研究提供了更廣闊的思路，但是在小兒支氣管哮喘疾病的病因和機(jī)制研究中缺乏一定的客觀標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)理論與代謝組學(xué)研究方法的結(jié)合，為中醫(yī)學(xué)在小兒支氣管哮喘的病因及機(jī)制研究中開辟了新的思路。

1 代謝組學(xué)的定義及研究技術(shù)

代謝組學(xué)（metabonomics）是由 Nicholson 及其同事于1999年首次在已有的基因、轉(zhuǎn)錄和蛋白組學(xué)之后的一門創(chuàng)新性組學(xué)分支[5]，主要是通過分子生物學(xué)技術(shù)對低分子代謝產(chǎn)物（一般分子量小于1 000）進(jìn)行定性定量分析。針對不同的研究個體以及研究結(jié)果，可以大致將代謝組學(xué)分析層次總結(jié)為代謝靶向目標(biāo)分析、代謝指紋圖譜分析、代謝輪廓分析以及代謝組學(xué)分析4個研究層次[6]。其研究流程包括樣品的采集和處理、定性定量分析、數(shù)據(jù)處理、相關(guān)生物標(biāo)記物繼代謝途徑的尋找、生物學(xué)意義的獲取等[7]。每一種技術(shù)都有各自的有點(diǎn)，為了更大地發(fā)揮其優(yōu)點(diǎn)，把多種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用到對生物代謝的分析中，其中以核磁共振、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用最為廣泛[8]。

2 代謝組學(xué)中生物標(biāo)記物的研究進(jìn)展

代謝組學(xué)的研究標(biāo)本具有多樣性，人本身作為一個不斷運(yùn)行的機(jī)體，參與機(jī)體代謝活動的各類組織液如血液、尿液、唾液等都處于動態(tài)的更替中，包括機(jī)體的細(xì)胞內(nèi)液、細(xì)胞中微小結(jié)構(gòu)以至于機(jī)體組織等都含有大量的機(jī)體代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物在機(jī)體受到外界刺激發(fā)生疾病或創(chuàng)傷的狀態(tài)下，都可以適時的反應(yīng)出機(jī)體內(nèi)的微觀變化并體現(xiàn)于整體，為研究疾病的發(fā)生、發(fā)展提供大量信息[9-10]。尿液本身作為機(jī)體通過復(fù)雜的轉(zhuǎn)換與代謝后排出體外的一類“廢液”，標(biāo)本收集簡單無創(chuàng)，臨床較易獲得，用于疾病的研究相對簡便且更有意義。CARRARO S等[11]采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，觀察哮喘組大鼠與正常組大鼠尿液的代謝組分變化，發(fā)現(xiàn)乳酸、檸檬酸等代謝產(chǎn)物在肝郁證哮喘組大鼠的尿液中較正常組是減少的，而乙酰乙酸、肌酸酐等 7 種代謝產(chǎn)物的含量則是增多的，從而初步分析出能夠反映哮喘組代謝特征的生物標(biāo)記物，為肝郁證哮喘的作用機(jī)制、作用靶向點(diǎn)提供了依據(jù)。體質(zhì)存在能量代謝、氨基酸代謝及糖代謝的差異。

呼氣冷凝液是人們呼氣后產(chǎn)生的一種高度稀釋的體液，其檢測具有無創(chuàng)傷、易操作、可反復(fù)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，在兒童的肺部疾病研究中高度可行?，F(xiàn)已有研究證實(shí)呼氣冷凝液的 NMR 譜可以區(qū)分出哮喘兒童和健康兒童，其精確度為 86%。IBRAHIM B等[12]通過呼氣冷凝集液的 NMR 分析哮喘患者與健康組小分子代謝產(chǎn)物的差異性分布發(fā)現(xiàn)，不同表型的哮喘其小分子代謝產(chǎn)物分布存在差異性，因此可分為嗜酸性粒細(xì)胞增多型、中性粒細(xì)胞增多型、哮喘控制型和使用糖皮質(zhì)激素治療的哮喘型等。

綜上所述，在支氣管哮喘發(fā)作的病程中，獲得生物體體液或血液等樣本，利用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測其中的生物標(biāo)記物，尋找出具有生物學(xué)意義的差異性標(biāo)志物，通過這些差異性代謝產(chǎn)物找到與之相對應(yīng)的代謝通路，經(jīng)過進(jìn)一步研究與分析其中的關(guān)系，成為甄別中醫(yī)證型的客觀性向?qū)АＤ壳霸絹碓蕉嗟膶W(xué)者已發(fā)現(xiàn)一些與支氣管哮喘疾病發(fā)作機(jī)制相關(guān)的代謝通路及特異性生物標(biāo)記物，這些研究的成果都為進(jìn)一步的探索支氣管哮喘的病理生理機(jī)制，以及對指導(dǎo)個體的治療和預(yù)防有著極其重要的意義。

3 代謝組學(xué)技術(shù)在支氣管哮喘疾病中的研究

隨著醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的進(jìn)步，代謝組學(xué)這項(xiàng)新興研究分析技術(shù)的快速發(fā)展，逐漸形成了從上至下的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，廣泛運(yùn)用于各種疾病的研究。收集支氣管哮喘兒童的外周血液、大小便、呼氣冷凝液、肺泡灌洗液等標(biāo)本并測定，以發(fā)現(xiàn)其特定的生物標(biāo)記物，通過對其進(jìn)行定性及定量分析，尋找與標(biāo)記物相關(guān)的代謝途徑，并分析其發(fā)病過程中特定標(biāo)志物的變化過程，最終獲得其生物學(xué)意義及可能存在的發(fā)病機(jī)制，為該病的診治、疾病評估、療效分析及預(yù)后提供理論依據(jù)。

VERCELLI D[13]通過構(gòu)建小鼠哮喘模型表達(dá)芯片譜精氨酸酶I 和精氨酸酶II 濃度高低與哮喘的炎癥介質(zhì)IL-4 和IL-13 表達(dá)具有相關(guān)性，因此可推斷哮喘的發(fā)病機(jī)制可能與精氨酸通路密切相關(guān)。PETERSGOLDEN M等[14]發(fā)現(xiàn)花生四烯酸代謝通路與支氣管哮喘急性發(fā)作高度相關(guān)，并可作為疾病嚴(yán)重程度的特異性標(biāo)志物。李永霞等[15]通過檢測支氣管哮喘患者急性發(fā)作期與緩解期兩個不同時期患者血清中的8-異前列腺素水平，證實(shí)急性發(fā)作期血清中的 8-異前列腺素明顯升高，而經(jīng)治療后其水平可顯著降低，但都仍高于正常組患者。因此，8-異前列腺素可作為評價該病嚴(yán)重程度及療效的生物標(biāo)志物 。

4 代謝組學(xué)技術(shù)在支氣管哮喘中醫(yī)方向的研究

中醫(yī)證候是指對某種疾病在某一發(fā)展階段的起病原因、發(fā)生機(jī)制、疾病性質(zhì)等的概括性描述。利用代謝組學(xué)，可以更加完全的反映出疾病的內(nèi)在圍觀變化，使“證候”得到客觀、定性、定量的描述，從而促進(jìn)中醫(yī)證候本質(zhì)的研究。由于生物體在不同生理及病理階段有著特殊的代謝模式，有學(xué)者運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)證侯，找到與支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制可能相關(guān)的代謝通路，篩選出與“證型”相關(guān)的特異性生物標(biāo)記物，為中醫(yī)證型的區(qū)分提供了理論基礎(chǔ)。代謝組學(xué)采用了一種接近身體內(nèi)環(huán)境的方法，利用身體機(jī)能受到外界刺激而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物及廢物的變化，對生物體進(jìn)行的一種無損傷研究，打破了傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法的局限性，利用某一些特異性的生物標(biāo)記物，找到完整的代謝通路，建立起一個相對完整的疾病發(fā)生時生物體的病理生理改變，更加系統(tǒng)的闡述了疾病的發(fā)生、發(fā)展以及對治療和防治的重要意義，這與中醫(yī)學(xué)的“整體觀”和“動態(tài)觀” 相似，代謝組學(xué)作為一種新的研究手段與中醫(yī)學(xué)相結(jié)合，微觀上從小分子代謝物，宏觀上從整體代謝通路延伸至疾病機(jī)制，為中醫(yī)證候的甄別添加了更具有說服力的客觀證據(jù)。

牛曉曼等[16]運(yùn)用1-HNMR代謝組學(xué)方法研究脾虛型痛風(fēng)患者糞便中的生物標(biāo)記物，得出與正常健康人相比較，其中丁酸、丙氨酸、牛磺酸等生物標(biāo)記物含量有明顯變化，與非脾虛型的痛風(fēng)患者相比，其中異亮氨酸、亮氨酸等代謝物含量具有差異。周賢梅等[17]選擇肺癌痰濕蘊(yùn)肺證、氣陰兩虛證患者與健康志愿者的呼氣冷凝液為標(biāo)本，利用氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)分析呼氣冷凝液代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了 9 種潛在的可能與腫瘤疾病相關(guān)的代謝標(biāo)志物，其中 3 種為2個實(shí)驗(yàn)組特有化合物，6 種為3個實(shí)驗(yàn)組共有化合物；3-氨基-2-苯甲?；?4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩為痰濕蘊(yùn)肺組特有化合物，1-(苯基磺?；?吡咯為氣陰兩虛組特有化合物。得出呼氣冷凝液中存在著對肺癌具有診斷意義的代謝產(chǎn)物，肺癌不同中醫(yī)證型的臨床客觀化指標(biāo)的研究的可能性。陶嘉磊等[18]運(yùn)用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS/MS），分析小兒支氣管哮喘發(fā)作期痰熱阻肺證、非痰熱阻肺證尿液代謝物，發(fā)現(xiàn)與非痰熱阻肺證患兒相比，痰熱阻肺證患兒尿液中的草酸、L-蘇氨酸、嘧啶等 9 種物質(zhì)含量下降，主要涉及戊糖磷酸途徑，肌醇磷酸代謝等 4 條代謝通路，從而得出，支氣管哮喘發(fā)作期不同證型間存在代謝標(biāo)記物與代謝通路基礎(chǔ)。吳澤明等[19]通過液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對維吾爾醫(yī)異常黑膽質(zhì)證哮喘患者的血清中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，篩選出可能與異常黑膽汁型哮喘發(fā)生相關(guān)的 15 個代謝產(chǎn)物，是維吾爾醫(yī)在支氣管哮喘的診治過程中有了可靠的依據(jù)。陳黎等[20]利用GC/MS代謝組學(xué)技術(shù)通過研究小兒哮喘患者尿液中的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)與正常小兒相比，哮喘患兒尿液中的磷酸鹽、L-蘇氨酸、L-脯氨酸等18種代謝物存在明顯的差異，通過分析代謝通路，得出能量代謝、氨基酸代謝等代謝通路可能與哮喘疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)。茍小軍等[21]采用氣相色譜、質(zhì)譜技術(shù)檢測兒童哮喘肺脾氣虛型、氣陰兩虛型患者以及正常兒童的尿液中中小分子代謝物，利用代謝物譜庫得出兒童哮喘2種“證型”患者間尿液中的丁酸、磷酸鹽、L-蘇氨酸、肌酐、甘氨酸、D-葡萄糖、馬尿酸、假尿苷的相對含量存在顯著差異，這些代謝物與能量代謝、腸道菌群代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝異常相關(guān)，它們是區(qū)分這2種中醫(yī)證型的潛在生物標(biāo)記物。

綜上，代謝組學(xué)技術(shù)從微觀分析到宏觀概括也可以與中醫(yī)理論相結(jié)合，應(yīng)用于不同證型的支氣管哮喘患兒的研究，為哮喘疾病的辨證論治、探索病癥間的內(nèi)在聯(lián)系以及對疾病的預(yù)防提供了更深層次的依據(jù)。

5 小結(jié)

兒童支氣管哮喘是兒童常見的急癥之一，其反復(fù)發(fā)作仍是危害兒童身心健康的重要原因。近年來兒童哮喘的發(fā)病率及致殘率均有顯著升高，因此，早期診斷及合理的管理該疾病對降低其致殘率至關(guān)重要。目前，在國內(nèi)外都已經(jīng)有眾多學(xué)者開始利用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行支氣管哮喘疾病的研究，而中醫(yī)是屬于祖國的特色醫(yī)學(xué)，代謝組學(xué)生物標(biāo)志物可幫助解決這一關(guān)鍵問題，通過對哮喘患者的代謝廢物或代謝產(chǎn)物的特定生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測，可了解該病的診斷、分析、疾病活動度、嚴(yán)重程度及療效等，更簡潔、方便及無創(chuàng)的對哮喘患者進(jìn)行管理，這將對該類患者的診療及管理起到至關(guān)重要的作用。