呂亞楠，范 偉，胡 正

(吉林大學第一醫(yī)院轉化醫(yī)學院/免疫學研究所，吉林 長春130021)

小鼠作為模式動物常被用于研究哺乳動物尤其是人類的體內(nèi)免疫系統(tǒng)應答。然而物種之間的免疫系統(tǒng)存在差異[1]，致使從小鼠模型中得到的結論不能完全轉化給人類。因此，使用移植有人造血干細胞和(或)祖細胞的人源化小鼠成為一種研究人體免疫功能的更優(yōu)模型[2]。然而，在目前已有的人源化小鼠模型中，人單核細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)細胞的發(fā)育和功能存在很大程度上的缺陷[3-4]。細胞因子在造血細胞的發(fā)育、分化及功能的行使過程中發(fā)揮著關鍵作用，例如，紅細胞的發(fā)育需要白細胞介素3(interleukin-3,IL-3)和紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)[5]，樹突狀細胞(dendritic cells, DC)的發(fā)育需要粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor， GM-CSF)和白細胞介素4(interleukin-4, IL-4)[6]，NK細胞的發(fā)育需要白細胞介素15(interleukin-15,IL-15)[7]。目前認為人源化小鼠中人類固有免疫細胞的發(fā)育缺陷很可能是由于小鼠細胞因子與相對應的人類細胞因子受體的反應性有限，已報道小鼠的IL-15、GM-CSF、IL-6、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)和IL-3均未在人細胞上起作用[8]。目前已報道的解決該問題的策略主要是使用編碼人細胞因子的轉基因小鼠，該方法會引起全身性的細胞因子高濃度導致造血干細胞的動員和衰竭[9]；或施用外源性人類細胞因子，該方法費時費力[7]；或是通過高壓注射遞送編碼人類細胞因子的DNA載體，其缺點在于人類細胞因子的持續(xù)表達只能維持2～3周[10]。

piggyBac(PB)轉座子系統(tǒng)是在一種粉蝶中被發(fā)現(xiàn)的。PB轉座子需要相應的轉座酶和酶的識別序列同時存在，其插入位點幾乎都在TTAA位點，而且可以攜帶多個基因使其在插入位點表達，轉座過程不留痕跡。2005年首次證實PB轉座子可以有效作用于小鼠基因轉移[11]。目前，PB已被用于人類細胞的基因組修飾[12]，包括哺乳動物轉基因、誘變、臨床相關細胞類型的離體修飾以及體內(nèi)哺乳動物的基因轉移[13]。 本研究首次將PB轉座子系統(tǒng)用于優(yōu)化人源化小鼠模型，將人IL-6、IL-3、IL-15、干細胞生長因子(stem cell growth factor,SCF)和GM-CSF基因連接后整合到PB轉座子質(zhì)粒中，并將其與表達轉座酶的質(zhì)粒共同高壓注入NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NCG)小鼠，使其在肝臟發(fā)生整合并實現(xiàn)長期表達。本實驗通過構建含有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF 5種細胞因子的表達質(zhì)粒，利用PB轉座子體系將目的基因整合到宿主小鼠細胞基因組中實現(xiàn)長期表達，以此優(yōu)化免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型，與目前已報道的方法比較，該方法靈活和簡單并且長效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 NCG 小鼠購自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院，動物許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF ELISA試劑盒購自美國R&D公司。流式細胞儀(FACS Fortessa)購自美國BD公司，HIMFD多功能酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 含有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因的PB轉座子質(zhì)粒的構建 化學合成人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因序列，每2個細胞因子之間用不同的蛋白接頭序列(Linker)連接，分別為T2A、F2A、P2A和E2A，最后一個基因末尾加入終止子，目的基因通過酶切位點5′NheⅠ和3′BamHⅠ克隆至載體PB轉座子，獲得目的質(zhì)粒(PB-5F)。同時構建綠色熒光蛋白(GFP)基因作為目的基因的PB轉座子質(zhì)粒(PB-GFP)，用于體外驗證PB轉座子體系的長效性表達情況。上述基因的合成及質(zhì)粒的構建由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。經(jīng)庫美生物科技有限公司測序驗證插入序列準確無誤。

1.3 PB-GFP轉染293T細胞 293T細胞分為陰性對照組(未轉染質(zhì)粒)、陽性對照組(轉染pLVTHM質(zhì)粒)、瞬時轉染組(轉染PB-GFP質(zhì)粒)和穩(wěn)定轉染組[共同轉染PB-GFP和轉座酶質(zhì)粒(super-PB)]。4組細胞轉染后第3天進行傳代，利用流式細胞術檢測各組細胞中GFP表達水平，每3 d 1次，共10次，每組3個復孔。

1.4 轉染后293T細胞中GFP陽性(GFP+)細胞百分率 棄掉培養(yǎng)基，用無菌PBS洗2次，棄去液體。每孔加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化5 min。DMEM完全培養(yǎng)基終止消化后收集到15 mL離心管中，600 g、4℃離心5 min。PBS重懸沉淀。取5×105個細胞加入到流式細胞儀上樣管中，加入3 mL FACS液體，600 g、4℃離心5 min。棄凈上清，加入100 μL FACS液體，在樣品中加入適量的PI進行流式細胞術檢測及分析，計算GFP+細胞百分率。

1.5 NCG小鼠尾靜脈高壓注射質(zhì)粒實驗 NCG小鼠分為瞬時轉染組和穩(wěn)定轉染組, 每組4只。瞬時轉染組為小鼠尾靜脈高壓注射PB-5F質(zhì)粒(50 μg/只)，穩(wěn)定轉染組為尾靜脈高壓注射PB-5F質(zhì)粒(50 μg/只)和super-PB質(zhì)粒(20 μg/只)。5 s內(nèi)注 射小鼠體質(zhì)量10%的液體量。

1.6 ELISA法檢測NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平 各組小鼠尾靜脈高壓注射后1、3、5和9 d，及隨后每周1次尾靜脈取血，離心分離血清，-80℃保存。ELISA法檢測NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平。實驗步驟：將試劑盒提前30 min置于室溫，準備標準品和樣品；標準品等比稀釋；血清樣品在37℃水浴中溶化后，所有組的樣品按同一比例稀釋；上樣，每孔加入50 μL準備好的標準品和樣品，封口后室溫孵育3 h；棄凈液體，用Wash buffer(1×)洗4次，300 μL/孔，每次1 min；棄凈液體，每孔加入200 μL結合液，封口后室溫孵育1 h；棄凈液體，用Wash buffer(1×)洗4次，每孔300 μL，每次1 min；棄凈液體，每孔加入200 μL底物，封口后避光室溫孵育30 min，顏色變藍；每孔加入50 μL終止液，混勻，顏色由藍變黃，終止顯色，在450 nm波長下測定吸光度(A)值。根據(jù)標準品的濃度和A值繪制標準曲線，在根據(jù)標準曲線計算小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平。

2 結 果

2.1 PB-5F質(zhì)粒構建 將連接后的人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因序列片段克隆至PB轉座子載體上，陽性克隆經(jīng)NheI和BamHI雙酶切鑒定，可切出2 955 bp的目的片段和6 846 bp的載體片段。見圖1。

2.2 各組293T細胞中GFP+細胞百分率 PB-GFP轉染293T細胞3 d后，陽性對照組、瞬時轉染組和穩(wěn)定轉染組293T細胞中GFP+細胞百分率(33.70%±0.10%、32.57%±0.19%和32.83%±0.58%)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；轉染30 d后，穩(wěn)定轉染組293T細胞中GFP+細胞百分率(4.61%±0.42%)明顯高于陽性對照組(0.58%±0.05%)和瞬時轉染組(0.86%±0.10%)(P<0.01)。見圖2。

M: DL 15 000 DNA marker；Lane 1:PB-5F;Lane 2:PB-5F digested with restriction enzyme.
圖1 PB-5F酶切鑒定電泳圖
Fig.1 Electrophoregram of identification of PB-5F with enzyme digestion

2.3 各組NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平 質(zhì)粒高壓注射第5天，穩(wěn)定轉染組和瞬時轉染組小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15和GM-CSF水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在小鼠血清中未檢測到SCF。見表1。質(zhì)粒高壓注射第30天，穩(wěn)定轉染組小鼠血清中IL-6、IL-15和GM-CSF水平分別為(1 906.89±564.26)、(239.92±44.65)和(840.67±267.12)ng·L-1，均高于瞬時轉染組[(509.22±34.72)、(125.15±15.77)和(162.69±37.34)ng·L-1](P=0.048，P=0.051，P=0.045)，而2組小鼠在第9天時血清中均未檢測出IL-3。質(zhì)粒高壓注射第60天，穩(wěn)定轉染組小鼠血清中仍能檢測出IL-6、IL-15和GM-CSF[495.02±233.34)、(90.26±25.20)和(162.34±115.87)ng·L-1]。

A-D:3 d; E-H:30 d; A,E:Negative control group; B,F:Positive control group; C,G:Transient transfection group; D,H:Stable transfection group.
圖2 轉染后不同時間點各組293T細胞中GFP+細胞百分率
Fig.2 Percentages of GFP+cells in 293T cells in various groups at different time points after transfection after transfection

表1 質(zhì)粒注射第5天2組NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15和GM-CSF水平Tab.1 Levels of IL-6, IL-3, IL-15, and GM-CSF in serum of NCG mice in two groups on 5 th day after plasmid injection

3 討 論

為了解決將動物模型中的研究發(fā)現(xiàn)轉化為臨床應用的局限性，研究人員設計并開發(fā)了“人源化小鼠”模型，以在細胞和分子水平上模擬人類。近年來研發(fā)的具有人類免疫系統(tǒng)的人源化小鼠模型用于理解疾病的發(fā)病機制以及評估藥物對于人類疾病的治療，研究的疾病主要包括癌癥、傳染病、自身免疫疾病和移植物抗宿主病等[14]。

盡管免疫系統(tǒng)人源化小鼠發(fā)展多年且在多領域中有著重要貢獻，但該模型在許多方面存在缺陷，主要包括：在重建的免疫系統(tǒng)中缺乏人紅細胞和中性粒細胞的重建[15]；人髓系細胞和NK細胞發(fā)育受損以及功能缺陷；B細胞發(fā)育不成熟，抗原特異性IgG產(chǎn)生過少等[16]。所有血細胞均由造血干細胞分化而來，細胞因子在分化過程中發(fā)揮著關鍵作用，但由于人與小鼠之間的進化分歧，很多細胞因子是物種特異性的，小鼠細胞因子無法作用于人的細胞而發(fā)揮功能[8]。為了克服細胞因子的障礙，目前可采用外源補充細胞因子重組蛋白、高壓注射表達細胞因子的DNA質(zhì)粒、感染誘導細胞因子表達的慢病毒和敲入相關基因等方法，改善小鼠的體內(nèi)環(huán)境使其更適合人免疫系統(tǒng)的發(fā)育。

本課題組開發(fā)了一種簡單、靈活且長效的技術，該技術不需要復雜的程序，易于應用到任何實驗室。采用該方法處理，人IL-6、IL-15和GM-CSF表達可存在2個月以上。與敲入細胞因子的小鼠不同，高壓注射轉座子體系的方法能夠準確控制細胞因子的誘導時間，從而準確調(diào)控細胞的分化發(fā)育，并且可根據(jù)不同目的而靈活選擇細胞因子的種類。

目前敲入人IL-6基因的人源化小鼠模型表現(xiàn)出適應性免疫功能明顯改善、T細胞和B細胞更好地植入及分化[17]。IL-6可以誘導CD4-CD8-胸腺細胞分化為CD4+CD8+和 CD4+CD8-細胞，成熟表型的B細胞隨著重建時間的延長而增加，24周后超過60%。與其他模型比較，表達人IL-6基因的人源化小鼠模型總IgG和抗原特異性IgG產(chǎn)生明顯增加，這種增加與IgG1記憶B細胞和漿母細胞的分化增強有關。因此，表達人IL-6基因的人源化小鼠模型改善了適應性免疫細胞的發(fā)育和功能。

IL-15可以誘導重建的NK細胞表現(xiàn)出正常的表型和功能。誘導人NK細胞表達NK受體的3個主要家族包括NK細胞活化性受體(NKG2D)、NK細胞抑制性受體(NKG2A和KIR)及天然細胞毒性受體(NKp46)[10]。細胞因子誘導的NK細胞能夠在體外和體內(nèi)裂解組織相容性復合體Ⅰ類分子(MHC Ⅰ)缺陷的靶細胞[18],并在聚肌胞苷酸(polyⅠ∶C)刺激時分泌干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)。此外，細胞因子誘導的NK細胞能夠針對腺病毒感染產(chǎn)生強烈反應，如IL-15和酪氨酸激酶3(Flt-3)/胎肝激酶2(Flk-2)配體處理的人源化小鼠發(fā)生廣泛的肝壞死和高水平的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)[19]。上述研究[10,18-19]表明:人IL-15誘導的NK細胞在表面表型和功能方面均正常。

人源化小鼠中GM-CSF和IL-4的表達可以刺激B細胞的成熟、CD5+B細胞的產(chǎn)生和CD209+DC的分化， 這些細胞因子處理的小鼠可以在免疫后產(chǎn)生明顯的抗原特異性IgG抗體應答[20]。IL-3和GM-CSF的表達誘導功能性人肺泡巨噬細胞的發(fā)育[21]。

引起人類疾病的某些病原體具有種屬特異性[10]。 例如，登革熱病毒感染人DC和單核細胞/巨噬細胞，惡性瘧原蟲感染人紅細胞，Epstein Barr病毒感染人B細胞，人類免疫缺陷病毒-1感染人巨噬細胞和T細胞。目前人源化小鼠對于上述感染的研究受到病原體靶細胞的缺失或者其存在的數(shù)量遠低于人體組織的阻礙。本研究結果表明：通過高壓注射遞送表達細胞因子基因的轉座子系統(tǒng)，可以增強人源化小鼠中特定人血細胞譜系重建的能力，有助于使人源化小鼠成為針對病原體感染后的免疫應答研究的更好模型。