陳 宏，張 偉，蘇玉明，宋倩男，董國(guó)玉，秦 琪，陳 群，隋博文

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒一科，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱 150300； 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，黑龍江 哈爾濱 150400)

變應(yīng)性哮喘是過敏原所引起的呼吸道慢性炎癥及氣道過度反應(yīng)而導(dǎo)致支氣管過度收縮，氣流阻塞和呼吸不順的一種常見疾病[1]。其免疫病理機(jī)制為過敏原活化免疫系統(tǒng)中的第2型輔助性T淋巴細(xì)胞(helper T cell, Th)[2-3]。白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)可通過B細(xì)胞同型開關(guān)介導(dǎo)免疫球蛋白E(immunoglobin E，IgE)合成。變應(yīng)原與IgE交聯(lián)使肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞迅速活化，組胺和白三烯等遞質(zhì)的釋放使血管通透性增加，平滑肌收縮和黏液分泌增加[4]。晚期過敏反應(yīng)的特征是嗜酸性粒細(xì)胞和Th2通過IL-4在變應(yīng)原部位補(bǔ)充和激活。補(bǔ)益肺腎法不僅能顯著改善哮喘患者的軀體健康，并且對(duì)患者的心理和情緒亦有顯著的改善作用[5]。本研究主要觀察和分析補(bǔ)益肺腎湯對(duì)變應(yīng)性哮喘大鼠模型Th1/Th2的影響，探討其治療變應(yīng)性哮喘的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量(200±10)g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2014-0007]。

1.2 藥物 補(bǔ)益肺腎湯(黃芪20 g，丹參、太子參、麥冬、烏梅各15 g，五味子、陳皮、姜半夏、地龍、瓜蔞仁各10 g，川貝母、炒蘇子、磁石、補(bǔ)骨脂、紫河車、桃仁各8 g)為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑(批號(hào) 1812283)。將上述藥物在實(shí)驗(yàn)室制成煎劑，經(jīng)蒸餾水常規(guī)煎煮，4 ℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)可稍加熱。

1.3 試劑 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、伊文思藍(lán)：美國(guó)Sigma公司；吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗：武漢生物制品研究所；生理鹽水、乙醚、丙酮、結(jié)晶氯化鋁：上海蘇燃化學(xué)試劑公司；氫氧化鈉：天津科密歐化學(xué)試劑公司；大鼠OVA特異性IgE試劑盒：美國(guó)R&D公司；IgE、IL-4、干擾素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)定量夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒：上海西唐生物有限公司。

1.4 儀器 ELX 800UV型酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Tek公司；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；UV9600型紫外/可見光分光光度計(jì)：北京瑞麗分析儀器公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立與分組

2.1.1 氫氧化鋁凝膠的配制 按照氫氧化鋁凝膠的規(guī)范配制方法[7]，重復(fù)此過程，反復(fù)洗滌沉淀后收集，即得氫氧化鋁凝膠。

2.1.2 動(dòng)物分組 將SD大鼠放于自制的密閉玻璃箱內(nèi)，超聲霧化0.5%磷酸組胺鹽生理鹽水溶液刺激大鼠，觀察大鼠吸入組胺后的呼吸變化情況，選擇吸入組胺后20 s內(nèi)出現(xiàn)呼吸急促，前肢縮抬，點(diǎn)頭或腹式呼吸等哮喘癥狀的大鼠作為試驗(yàn)用鼠。共篩選出60只大鼠，將其按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，包括正常對(duì)照組、模型組、生理鹽水組、補(bǔ)益肺腎組，每組15只。

2.1.3 模型復(fù)制 ①致敏階段。分別于第1天、第14天，將新鮮配制的含1% OVA 1 mg及10%氫氧化鋁凝膠1 mg的生理鹽水混懸液共1 mL，皮下注射于模型組、生理鹽水組和補(bǔ)益肺腎組大鼠四肢內(nèi)側(cè)，每點(diǎn)各0.2 mL，并腹腔注射0.2 mL，同時(shí)腹腔注射1 mL滅活百日咳桿菌5×109個(gè)，正常對(duì)照組按照上述同樣途徑給予生理鹽水代替。②激發(fā)階段。模型組、生理鹽水組和補(bǔ)益肺腎組大鼠于第21天以1.0% OVA進(jìn)行霧化吸入，激發(fā)哮喘，每次霧化30 min，連續(xù)7 d。

2.2 給藥方法 于致敏前、致敏第14天經(jīng)大鼠腹腔注射OVA，每只100 μg，第21天開始對(duì)大鼠進(jìn)行5% OVA霧化，連續(xù)7 d，每次30 min，建立變應(yīng)性哮喘大鼠模型。①補(bǔ)益肺腎湯組：第21天模型復(fù)制成功后，于每次激發(fā)前30 min以補(bǔ)益肺腎湯每日10 mL/kg灌胃，給藥4 h后觀察大鼠癥狀。②生理鹽水組：模型復(fù)制成功后，于每次激發(fā)前30 min，給予同容積生理鹽水灌胃，給藥4 h后觀察大鼠癥狀。

2.3 觀察指標(biāo) 末次抗原激發(fā)30 min后頸椎脫臼處死大鼠，摘眼球取血，將血液置于抗凝管中，靜置30 min后，1 500 r/min離心15 min，取血漿，-20 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清IgE、IL-4水平，并且檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid，BALF)中IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平。分離小鼠脾，加入小鼠淋巴細(xì)胞分離液，提取單個(gè)核細(xì)胞，加入細(xì)胞刺激劑，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾Th1、Th2比例。

3 結(jié)果

3.1 4組大鼠血清IgE和IL-4水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IgE和IL-4水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)益肺腎組血清IgE和IL-4水平均顯著降低(P<0.05)；補(bǔ)益肺腎組大鼠血清IgE和IL-4水平顯著低于生理鹽水組(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠血清IgE和IL-4水平比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與生理鹽水組比較，△P<0.05

3.2 4組大鼠BALF中IFN-γ及IL-4水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠BALF中INF-γ水平顯著降低(P<0.05)，IL-4水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，生理鹽水組和補(bǔ)益肺腎組大鼠BALF中IL-4水平明顯降低(P<0.05)，IFN-γ水平明顯上升(P<0.05)；補(bǔ)腎益肺湯組大鼠BALF中IFN-γ水平顯著高于生理鹽水組(P<0.05)，兩組IL-4水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠BALF中IFN-γ、IL-4水平比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與生理鹽水組比較，△P<0.05

3.3 4組大鼠脾中Th1、Th2比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠脾中Th1/Th2顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，生理鹽水組和補(bǔ)益肺腎組大鼠脾中Th1/Th2明顯上升(P<0.05)；補(bǔ)腎益肺組大鼠脾中Th1/Th2顯著高于生理鹽水組(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠脾中Th1、Th2比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與生理鹽水組比較，△P<0.05

4 討論

西醫(yī)多采用糖皮質(zhì)激素治療哮喘，但難以避免激素全身給藥的不良反應(yīng)，近年來提倡噴吸給藥以局部抗炎，但此法對(duì)哮喘急性發(fā)作期無效。研究表明，中醫(yī)藥治療該病具有顯著療效，如小青龍湯具有降低血清IgE的作用，補(bǔ)腎法可抑制哮喘氣道反應(yīng)性增高，維持氣道的穩(wěn)定[5-6]。從多年的臨床經(jīng)驗(yàn)[7]來看，中西醫(yī)結(jié)合治療，在變應(yīng)性哮喘加重之時(shí)是最佳的選擇。但是，在患者的哮喘緩和期，中醫(yī)補(bǔ)脾益肺、培土生金法具有明顯療效。體內(nèi)伏痰遇誘因而觸發(fā)，使氣機(jī)升降出入失常，乃是本病病機(jī)之根本。臨床上，在哮喘患者中肺腎氣虛證候非常多見。補(bǔ)腎法已不拘于“急則治標(biāo)，緩則治本”的傳統(tǒng)原則，而廣泛運(yùn)用于變應(yīng)性哮喘各期[8]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病與體質(zhì)因素、生活環(huán)境、飲食、情志有密切關(guān)系，內(nèi)因在于肺、脾、腎不足，而外因在于感受外邪、飲食失調(diào)或情志不暢等。肺、脾、腎不足，臟腑功能失調(diào)，津液運(yùn)化輸布障礙，聚而生痰，留宿于肺，閉阻氣道，肺氣不利，血行不暢而血滯成瘀，痰瘀交結(jié)，蘊(yùn)伏于內(nèi)，成為哮喘之宿根[9]。

氣道炎癥是哮喘患者氣道可逆性阻塞和非特異性支氣管高反應(yīng)性的重要決定因素。氣道炎癥產(chǎn)生的途徑可根據(jù)是否有抗體介導(dǎo)和主體細(xì)胞的不同，可分為IgE介導(dǎo)、T淋巴細(xì)胞依賴的炎癥途徑和非IgE介導(dǎo)、T淋巴細(xì)胞依賴的炎癥途徑兩大類。哮喘患者體內(nèi)IgE增多與體內(nèi)Th2數(shù)目增加、功能亢進(jìn)導(dǎo)致的IL-4、IL-13增加，IFN-γ水平下降有關(guān)。變應(yīng)性哮喘患者體內(nèi)Th0轉(zhuǎn)化為Th1減少，轉(zhuǎn)化為Th2增多，從而導(dǎo)致Th1/Th2失調(diào)，使體內(nèi)IL-4、IL-13等Th2合成增多，這可能是造成變應(yīng)性哮喘患者體內(nèi)B細(xì)胞合成過量的IgE的主要原因[10]。研究顯示，Th1/Th2在體內(nèi)是互相調(diào)節(jié)的，氣喘的免疫機(jī)制為Th2較為優(yōu)勢(shì)，因此，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡并使之趨向Th1優(yōu)勢(shì)化，是氣喘治療的合理策略，亦是免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)展的方向[11]。

中醫(yī)藥在預(yù)防哮喘發(fā)作方面有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，根據(jù)中醫(yī)學(xué)“春夏養(yǎng)陽，秋冬養(yǎng)陰”的傳統(tǒng)理論，治療上以扶正固本，補(bǔ)益肺腎為立法之本，或佐活血化瘀之品。現(xiàn)代研究表明，補(bǔ)腎法能增強(qiáng)免疫功能，亦可調(diào)節(jié)丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)功能，而獲得平喘的遠(yuǎn)期療效，并防止季節(jié)性復(fù)發(fā)。本研究采用補(bǔ)益肺腎湯治療變應(yīng)性哮喘，方中黃芪補(bǔ)肺固表，五味子斂肺平喘，紫河車納氣補(bǔ)腎，山茱萸益腎，款冬花、姜半夏止咳平喘、溫肺化痰，諸藥合用，達(dá)到化痰溫肺的功效。本研究表明，正常對(duì)照組和補(bǔ)益肺腎組血清IgE和IL-4水平均低于模型組和生理鹽水組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，補(bǔ)益肺腎組大鼠BALF中IL-4水平顯著降低(P<0.05)，IFN-γ水平顯著上升(P<0.05)。4組大鼠脾中Th1/Th2差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，補(bǔ)益肺腎湯可能通過下調(diào)IL-4水平，提高IFN-γ水平，改善變應(yīng)性哮喘大鼠體內(nèi)Th1/Th2失衡。