林 樺 鄧海燕 曾 奇 莫曉勇

（1.中林集團雷州林業(yè)局有限公司，廣東 湛江 524043；2.華南農(nóng)業(yè)大學 林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642）

植物組織培養(yǎng)是目前植物無性繁殖最有效的方式，通過組織培養(yǎng)可以保持良種的優(yōu)良性狀。優(yōu)樹幼化的器官基因型相同，遺傳性狀也相同，通過快速繁殖，可成為遺傳穩(wěn)定且數(shù)量巨大的無性系群體，當前人工用材林苗木大部分來自于此[1]。在中國，桉樹已經(jīng)支撐起了一個完整的產(chǎn)業(yè)鏈，包括制漿造紙產(chǎn)業(yè)和人造板產(chǎn)業(yè)。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進行桉樹離體快繁，既有利于保持良種的優(yōu)良性狀又能滿足當前營造速生林的種苗需求，具有良好的經(jīng)濟效益和發(fā)展前景[2]。本實驗將通過對已經(jīng)進行過無性系測定的M8 桉樹無性系進行研究，采用組培叢芽發(fā)生途徑，對接入外植體建立無菌系、誘導(dǎo)叢芽、增殖培養(yǎng)不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化篩選，以獲得較優(yōu)的組培配方，期望為其組培擴繁技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 外植體獲取

在尾巨桉（Eucalyptus urophylla×E.grandis）M8（以下簡稱M8）大樹離基部20 cm 的地方，往上環(huán)割一圈8～ 10 cm 的切口，環(huán)割1～ 2 個月后對要采集的枝條提前3～ 5 d 進行遮光預(yù)處理，亦可提前3 天噴灑抗菌藥品等，采集萌條時間為3至4 月份。在天氣晴朗的上午11:00 時左右，從試驗?zāi)副旧霞羧а壳o段萌條作為外植體，去掉大部分葉片，注意保鮮，避免失水。

1.2 外植體消毒

將采回的枝條先用含有0.02%（適當?shù)稳霂椎渭纯桑┑南礉嵕芤航?0 min，用棉花輕輕擦洗表面，清水沖洗2～ 3 h。然后去掉全部葉片，按葉芽將莖修剪成2～ 3 cm 的小段，葉芽處于中間位置，修剪好后根據(jù)枝條幼嫩程度分組，放入滅菌三角瓶里密封帶入試驗室。在操作臺上先用無菌水沖洗1～ 2 次，再進行消毒處理。消毒方法：如果枝條比較老，則需要先用75%酒精浸泡30 s 后，用無菌水沖洗1 次再用升汞消毒；如枝條較嫩則可只用升汞消毒。本次枝條消毒采用的是升汞二次消毒法：先用0.1%的升汞溶液浸泡莖段1～ 3 min，并輕晃三角瓶，接著用無菌水快速沖洗5～ 7 次，無菌水的第1 次沖洗一定要迅速，避免升汞殘留濃度影響，第2 次以后沖洗晃動三角瓶應(yīng)大于1 min；沖洗完將莖段放入盤中進行切割，將小段上下末端分別切去0.5 cm 左右，再用0.1%升汞消毒1 min，最后再用無菌水快速沖洗5～7次。消毒完畢后將莖段接入MS+6-BA 0.2 mg/L +蔗糖 30 g/L+卡拉膠 6.8 g/L，pH 為5.8 的培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基接入1 個莖段。接種后每天進行觀察記錄，統(tǒng)計污染率及誘導(dǎo)率。

1.3 增殖培養(yǎng)

設(shè)置不同基本培養(yǎng)基、不同濃度的 6-BA、不同濃度的 IBA、不同濃度蔗糖和不同pH 值的試驗處理，將萌發(fā)長至1 cm 左右的腋芽切下，接種到不同處理的增殖培養(yǎng)基上。每個處理接種5 瓶，每瓶8 個芽，均重復(fù)3 次。置于光照強度1 500～2 000 lx、光照時間12 h/d、溫度為25 ℃的條件下進行培養(yǎng)。接種20 d 后統(tǒng)計相關(guān)數(shù)據(jù)及苗生長狀況。

1.3.1 不同基本培養(yǎng)基的配制 由于本實驗的基本培養(yǎng)基MS 的效果已經(jīng)較好，故篩選最佳培養(yǎng)基只在MS 培養(yǎng)基內(nèi)篩選，采用以下5 種含量的MS 培養(yǎng)基進行試驗（表1）。每個處理中的其他添加物均為6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠 6.8 g/L。

表1 不同基本培養(yǎng)基的增殖試驗Table 1 Multiplication tests of different minimal medium

1.3.2 不同濃度的6-BA 或IBA 的設(shè)置 每處理的基本培養(yǎng)基均為改良MS（表2）。對于不同濃度的 6-BA 的增殖試驗，其他添加物為 IBA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+卡拉膠 6.8 g/L。對于不同濃度的IBA 的增殖試驗，其他添加物為 6-BA 0.2 mg/L +蔗糖 30 g/L+卡拉膠 6.8 g/L。

表2 不同濃度的 6-BA 的增殖試驗Table 2 Multiplication tests of 6-BA at different concentrations

1.3.3 不同蔗糖濃度、不同pH 值的設(shè)置 植物組織培養(yǎng)過程中，不同的碳源濃度、培養(yǎng)基的酸堿度、凝固劑用量和光照強度均會對繼代增殖產(chǎn)生影響。本試驗探索了蔗糖濃度、培養(yǎng)基的pH 值對M8的增殖效果的影響（表3）。每處理的基本培養(yǎng)基均為改良MS，其他添加物為6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L+卡拉膠 6.8 g/L。

表3 不同蔗糖濃度和pH 值的增殖試驗Table 3 Multiplication tests of different sucrose concentrations and pH values

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗中所有數(shù)據(jù)采用WPS 2013 和SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。

誘導(dǎo)率 (%)=(誘導(dǎo)出腋芽的外植體數(shù)/接種總數(shù))×100

污染率 (%)=(污染總數(shù)/接種總數(shù))×100

發(fā)芽率 (%)=(發(fā)芽總數(shù)/接種總數(shù))×100

增殖系數(shù)=總芽數(shù)/接種芽數(shù)

有效芽數(shù)：芽長 ≥ 1.2 cm 的芽數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 無性系M8 無菌系的建立

接種于MS+6-BA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基中的外植體，在接種后的第5～7 天葉柄基部開始出現(xiàn)白色圓環(huán)狀裂痕，葉柄開始脫落；部分腋芽開始萌動，15～ 20 d 后腋芽長至1 cm 左右，由此可見，該培養(yǎng)基適于M8 外植體腋芽的誘導(dǎo)。平均污染率為15.3%，平均誘導(dǎo)率為77.9%。

2.2 增殖培養(yǎng)

2.2.1 不同基本培養(yǎng)基對M8 無菌芽增殖效果的影響 從表4 可知，不同含量的MS 培養(yǎng)基對增殖系數(shù)和有效芽數(shù)的影響較大。培養(yǎng)至20 d 時，苗高由高到低排序為EM5(改良MS)＞ EM4(2MS)＞EM3(MS)＞ EM2(3/4MS)＞ EM1(1/2MS)，其 中 每瓶苗高均值的極大值2.95 cm 出現(xiàn)在EM5 中，極小值為EM1 的1.65 cm。不同處理的每瓶有效芽數(shù)從大到小順序為EM5 ＞ EM3 ＞ EM4 ＞ EM2 ＞EM1；其中每瓶有效芽數(shù)的極大值為41，出現(xiàn)在EM5 中，極小值為15 出現(xiàn)在EM1 中。增殖系數(shù)上不同處理由大到小順序為EM3 ＞ EM5 ＞ EM2 ＞EM4 ＞ EM1；其中每瓶增殖系數(shù)極大值為4.7，出現(xiàn)EM3 中，極小值1.8 出現(xiàn)在EM1 中。

方差分析可知，不同含量的MS 培養(yǎng)基處理的每瓶苗高均值、每瓶有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)的F值分別為5.302、22.205 和60.996，均為P＜ 0.01，表明不同處理間的苗高、有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)均存在極顯著差異。由多重比較結(jié)果可得，EM5處理的苗高與EM1 處理的苗高有顯著差異，余下3 個處理間無顯著差異；EM5、EM3 與EM4、EM2、EM1 在每瓶有效芽數(shù)上有顯著差異；EM3、EM5 與EM2、EM4、EM1 在增殖系數(shù)上有顯著差異。結(jié)合苗的生長情況來看（表4），隨著培養(yǎng)基母液含量的增加，苗的整體生長情況的指標值是呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當培養(yǎng)基母液含量為一倍MS(EM3)時生長情況最好。同時，EM3 和EM5 處理的整體表現(xiàn)相當，尤其在增殖階段的增殖系數(shù)和有效芽數(shù)都很高，但是EM3 會出現(xiàn)苗上長愈傷的情況，而改良后的MS 培養(yǎng)基EM5 則沒有出現(xiàn)長愈傷的情況，所以EM5(改良MS)是M8增殖階段的最佳培養(yǎng)基。

表4 不同基本培養(yǎng)基對增殖效果的影響Table 4 Effects of different minimal medium on multiplication

2.2.2 不同濃度的 6-BA 對M8 無菌芽增殖效果的影響 從表5 可知，當IBA 固定為0.1 mg/L 時，不同含量的6-BA 對增殖系數(shù)和有效芽數(shù)的影響較大。接種20 d 時，苗高由高到低排序為A2 ＞ A3 ＞A1 ＞ A4 ＞ A5，其中每瓶苗高均值的極大值2.95 cm 出現(xiàn)在A2 處理中，極小值1.32 cm 出現(xiàn)在A5處理中。不同處理的每瓶有效芽數(shù)從大到小順序為A2 ＞ A3 ＞ A4 ＞ A5 ＞ A1；其中每瓶有效芽數(shù)的極大值為49，出現(xiàn)在A2 處理中，極小值為10，出現(xiàn)在A1 處理和A5 處理中。增殖系數(shù)上不同處理由大到小順序為A2 ＞ A3 ＞ A4 ＞ A5 ＞ A1；其中每瓶增殖系數(shù)極大值為5.2，出現(xiàn)在A2 中，極小值為1.2，出現(xiàn)在A1 和A5 中。

表5 不同濃度6-BA 對增殖效果的影響Table 5 Effects of different concentrations of 6-BA on multiplication

6-BA 對增殖系數(shù)和有效芽數(shù)的影響較大。在6-BA 的濃度為0 的處理A1 中，其增殖系數(shù)和有效芽數(shù)都很少，腋芽萌發(fā)量少，苗矮小且長勢不好，少量苗有根長出；在6-BA 濃度為1～ 2 mg/L的處理A4、A5 中，隨著6-BA 濃度的升高，苗的有效芽越少、產(chǎn)生的愈傷越多、苗長勢越差、葉色發(fā)黃；在6-BA 濃度由0 增加到0.2～ 0.5 mg/L(A2、A3)時，M8 的有效芽數(shù)和增殖系數(shù)都提高了1～ 2 倍，葉色翠綠且舒展，苗的長勢也很好。

方差分析可知，不同濃度的6-BA 處理的每瓶苗高均值、每瓶有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)的F值分別為20.235、72.441 和138.196，均有P＜ 0.01，表明不同處理間的苗高、有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)均存在極顯著差異。由多重比較結(jié)果可知，A2、A3 處理的苗高與A4、A5 處理的苗高有顯著差異；A1 處理與A5 處理間每瓶有效芽數(shù)上無顯著差異，與其他處理間均有顯著差異；A1 處理與A5 處理間增殖系數(shù)上無顯著差異，與其他處理間均有顯著差異。綜上所述，適宜M8 增殖的6-BA濃度為0.2～ 0.5 mg/L。

2.2.3 不同濃度的 IBA 對M8 無菌芽增殖效果的影響 從表6 可知，當6-BA 固定為0.2 mg/L 時，接種20 d 后，苗高由高到低排序為B4 ＞ B3 ＞ B5＞ B2 ＞B1，其中每瓶苗高均值的極大值2.95 cm出現(xiàn)在B4 處理中，極小值1.52 cm 出現(xiàn)在B1 處理中。不同處理的每瓶有效芽數(shù)從大到小順序為B4 ＞ B5 ＞ B3 ＞ B2 ＞B1 ；其中每瓶有效芽數(shù)的極大值為37，出現(xiàn)在B4 處理中，極小值為11，出現(xiàn)在B2 處理中。增殖系數(shù)上不同處理由大到小順序為B4 ＞ B5 ＞ B3 ＞ B2 ＞B1；其中每瓶增殖系數(shù)極大值為4.8，出現(xiàn)在B4 處理中，極小值為2.1，出現(xiàn)在B1 處理中。

當IBA 濃度為0 時(B1)，苗高增長率只有80%左右；當IBA 濃度位于0.01～ 0.1 mg/L 之間時(B2、B3、B4)，隨著其濃度的升高，苗高、有效芽數(shù)和增殖系數(shù)都升高，苗的葉片翠綠，趨于舒展，愈傷減少，長勢也由一般變?yōu)楹茫划擨BA濃度為0.2 mg/L 且等于6-BA 濃度時(B5)，苗高降低，有效芽數(shù)和增殖系數(shù)依舊保持在良好水平，產(chǎn)生了少量的愈傷組織（表6）。

表6 不同濃度IBA 對增殖效果的影響Table 6 Effects of different concentrations of IBA on multiplication

方差分析可知，不同濃度的IBA 處理的每瓶苗高均值、每瓶有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)的F值分別為18.378、36.679 和22.348，均有P ＜ 0.01，表明不同處理間的苗高、有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)均存在極顯著差異。由多重比較結(jié)果可知，B4 處理的苗高與余下4 個處理的苗高有顯著差異；B4、B5 處理與B1、B2、B3 處理間每瓶有效芽數(shù)上有顯著差異；B4 處理與B1 處理間增殖系數(shù)上有顯著差異，B2、B3、B5 處理間無顯著差異。綜上所述，低濃度IBA 較適宜M8 增殖，濃度范圍為0.05～ 0.2 mg/L，產(chǎn)生的葉翠綠、芽粗壯、愈傷少、長勢好。

2.2.4 不同蔗糖濃度對M8 無菌芽增殖效果的影響 從表7 可知，接種20 d 后，苗高由高到低排序為S3 ＞ S4 ＞ S2 ＞ S5 ＞ S1，其中每瓶苗高均值的極大值2.92 cm 出現(xiàn)在S3 處理中，極小值1.65 cm出現(xiàn)在S1 處理中。不同處理的每瓶有效芽數(shù)從大到小順序為S3 ＞ S4 ＞ S5 ＞ S1 ＞ S2；其中每瓶有效芽數(shù)的極大值為36，出現(xiàn)在S3 處理中，極小值為11，出現(xiàn)在S2 處理中。增殖系數(shù)上不同處理由大到小順序為S3 ＞ S4 ＞ S2 ＞ S5 ＞ S1；其中每瓶增殖系數(shù)極大值為5.2 出現(xiàn)在S3 處理中，極小值為1.5出現(xiàn)在S5 處理中。在蔗糖濃度為10～ 30 g/L 的處理 S1、S2、S3 中，低濃度處理S1 中苗產(chǎn)生了玻璃化的現(xiàn)象、葉片出現(xiàn)畸形，長勢很差，隨著濃度的升高增殖系數(shù)和苗高也增加，苗的葉片葉色變深，趨于舒展，長勢變好；當蔗糖濃度大于30g/L 時，隨著其濃度的升高，苗高、有效芽數(shù)和增殖系數(shù)呈現(xiàn)降低趨勢，苗的基部愈傷增多，影響苗對營養(yǎng)的吸收，葉片變黃脫落，長勢變差。

表7 不同蔗糖濃度對增殖效果的影響Table 7 Effects of different concentrations of sucrose on multiplication

方差分析可知，不同蔗糖濃度的處理，其每瓶苗高均值、每瓶有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)的F值分別為1.677、696.733 和13.638，均有P＜ 0.01，表明不同處理間的苗高、有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)均存在極顯著差異；S3 處理的苗高與余下4 個處理的苗高有極顯著差異。每瓶有效芽數(shù)除S1、S5處理無顯著差異外，其他均有極顯著差異；S1 處理與S5 處理間增殖系數(shù)上無顯著差異，S2、S3、S4 處理相互間有顯著差異。綜上所述，蔗糖濃度為30 g/L 的S3 處理最適宜M8 的增殖。

2.2.5 不同pH 值對M8 無菌芽增殖效果的影響從表8 可知，接種20 d 后，苗高由高到低排序為P3 ＞ P1=P2 ＞ P4 ＞ P5，其中每瓶苗高均值的極大值2.95 cm 出現(xiàn)在P3 處理中，極小值1.64 cm 出現(xiàn)在P5 處理中。不同處理的每瓶有效芽數(shù)從大到小順序為P3 ＞ P2 ＞ P1 ＞ P5 ＞ P4 ；其中每瓶有效芽數(shù)的極大值為34，出現(xiàn)在P3 處理中，極小值為15，出現(xiàn)在P5 處理中。增殖系數(shù)上不同處理由大到小順序為P3 ＞ P2 ＞ P1 ＞ P4 ＞ P5；其中每瓶增殖系數(shù)極大值為4.9，出現(xiàn)在P3 處理中，極小值為2.1，出現(xiàn)在P5 處理中。培養(yǎng)基的pH 值會影響培養(yǎng)基凝固的效果和軟硬程度，當pH 值為5 時(P1)，培養(yǎng)基的很軟，雖然增殖系數(shù)和有效芽數(shù)都不是很低，但是叢芽產(chǎn)生玻璃化的現(xiàn)象比較嚴重，葉片出現(xiàn)畸形，芽苗長勢差質(zhì)量差；當pH 值在5.4～ 6.4 的范圍內(nèi)時(P2、P3、P4)，其苗高、有效芽數(shù)和增殖系數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在這一范圍內(nèi)M8 都能正常生長，葉片翠綠舒展，長勢也好，表現(xiàn)最好的是P3 處理；當pH 值等于7 時(P5)，培養(yǎng)基很硬，苗生長質(zhì)量有所下降，葉片變黃脫落，苗高和增殖系數(shù)都有所下降。

表8 不同pH 值對增殖效果的影響Table 8 Effects of different pH value on multiplication

分析可知，不同pH 值的處理，其每瓶苗高均值、每瓶有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)的F值分別為25.191、55.542 和98.778，均有P＜ 0.01，表明不同處理間的苗高、有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)均存在顯著或極顯著差異。其中，P3 處理的苗高、每瓶有效芽數(shù)、增殖系數(shù)上均和其他4 個處理的有極顯著差異。P1、P2 和P5 處理間的苗高有極顯著差異。P2 處理的每瓶有效芽數(shù)和增殖系數(shù)與其余處理有極顯著差異。綜上分析，最適宜M8 增殖的pH 范圍為5.4～ 6.0。

3 結(jié)論與討論

桉樹是目前生長速度最快的人工林用材樹種，不僅樹干可取材，樹葉還可以用于提取桉油，用途十分廣泛，需求量十分巨大。本實驗對于已經(jīng)進行過無性系測定的優(yōu)良品種尾巨桉M8 進行了組織培養(yǎng)研究，對其外植體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)和無菌芽增殖培養(yǎng)進行了單因素影響因子的相關(guān)探索。

3.1 桉樹植物組織培養(yǎng)無菌苗的獲得有兩種途徑，一是通過誘導(dǎo)愈傷組織，再從愈傷組織分化出不定芽，這樣耗時長且繼代苗易發(fā)生變異；另一種途徑是采集嫩枝進行腋芽誘導(dǎo)，再以芽繁芽，這樣耗時較短且繼代苗較穩(wěn)定。本試驗選擇以芽繁芽方式，外植體消毒采用的是75%酒精加0.1%升汞二次消毒法，效果較好；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS +6-BA 0.2 mg/L+蔗糖 30 g/L+卡拉膠 6.8 g/L，pH為5.8，腋芽萌發(fā)很快，10～ 15 d 為出芽高峰期，平均誘導(dǎo)率為77.9%。

腋芽誘導(dǎo)階段常常會發(fā)生污染以及褐化的問題[3-4]。外植體的預(yù)處理對污染率、褐化率影響較大，外植體帶菌情況、引起褐變的物質(zhì)因生長季節(jié)不同而有所差異[5]。對大樹進行環(huán)割復(fù)幼可以得到生理年齡較小的枝條，采集枝條最好選擇春季，因為春季的植物內(nèi)生菌相對較少，可以適當降低污染率。徐南翔[6]對桉樹離體培養(yǎng)的研究表明，3-5 月份采集的外植體比下半年采集的外植體污染更少，且褐化率更低。采條部位也很重要，枝條下部的木質(zhì)化程度高，容易發(fā)生滅菌不充分或者滅菌過度死亡；枝條中上部則接種誘導(dǎo)成功率會高一些。采條之前提前一周對枝條進行遮光和殺菌處理，可以降低外植體攜帶微生物的幾率。

3.2 培養(yǎng)基的激素種類和濃度配比是影響有效芽數(shù)和增殖系數(shù)的重要因子，基本培養(yǎng)基只能保證植物的最低生存需求和生理活動，除了選擇合適的基本培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)條件，植物的愈傷組織誘導(dǎo)、腋芽誘導(dǎo)、增殖繼代和生根誘導(dǎo)最主要還是依賴激素的選擇。試驗分析了不同含量基本培養(yǎng)基的作用效果，篩選了不同種類及濃度配比的激素和蔗糖，得到結(jié)果如下：適宜M8 增殖的培養(yǎng)基為改良MS 培養(yǎng)基、6-BA 濃度為0.2～ 0.5 mg/L、IBA 濃度為0.05～ 0.2 mg/L，蔗糖濃度為 30 g/L、pH 值范圍為5.4～ 6.0。最終確定了最優(yōu)的繼代增殖培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L +蔗糖 30 g/L+卡拉膠 6.8 g/L，并將pH 調(diào)至5.4～6.0，可以獲得增殖系數(shù)為4.49 的增殖效果，且繼代苗葉片舒展，生長健壯，提高了組培效率，發(fā)揮了組培快繁的優(yōu)勢。

在尾巨桉M8 的培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了少量的玻璃化苗的情況。玻璃化苗的莖段和葉片呈現(xiàn)白色半透明狀，水漬化、脆弱易斷，增殖困難。玻璃化苗的實質(zhì)是在高溫高濕、高激素濃度的培養(yǎng)下，細胞分裂速度和體積增大速度過快，致使干物質(zhì)積累速度跟不上細胞增大速度，植物細胞只能用水分來填充體積，從而表現(xiàn)出水漬化和玻璃化。玻璃化苗的含水量很高，苗很脆弱，生長勢很差，基本無法成活，這也成為組培育苗的一大阻礙。本試驗中使用低濃度的細胞分裂素，控制培養(yǎng)基的pH 在5.4～ 6.0 之間，有效減少了玻璃化苗的出現(xiàn)。另有少量苗頂長愈傷組織的情況，在對MS的進行改良后，采用改良MS 培養(yǎng)基進行繼代增殖，愈傷得到了很好地控制。