曾家城 秦長生 趙丹陽 徐金柱 楊 華 田龍艷 邱華龍

(1.廣東省肇慶市廣寧縣林業(yè)局，廣東 肇慶 526500;2.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室/廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520）

油茶（Camellia oleifera）是世界四大木本油料之一，是中國特有的一種純天然高級油料，在林業(yè)、農漁、食療、醫(yī)藥、化工、日化、輕紡等方面具有廣泛的應用價值[1]。利用油茶果壓榨出的茶油健康營養(yǎng)，氣味清香，不僅不含芥酸、膽固醇、黃曲霉素等對人體有害的物質，而且具有抵抗紫外、延緩衰老、美容養(yǎng)顏、促進傷口愈合等諸多功效，被外界稱贊為“世界上最好的食用油”[2-3]。隨著茶油深加工技術的快速成熟發(fā)展，我國油茶種植、生產、深加工一體化全產業(yè)鏈體系正逐步形成并初具規(guī)模。根據國家林業(yè)局編制的《全國油茶產業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2009-2020）》，至2020 年全國油茶林面積將達到467 萬hm2。隨著油茶林面積和規(guī)模不斷擴大，油茶病蟲害的發(fā)生與危害也成日趨嚴重的態(tài)勢，嚴重影響油茶的產量和品質，對山區(qū)油茶產業(yè)經濟的健康發(fā)展和全面實現(xiàn)小康造成巨大威脅[4-6]。

油茶專性蛀果害蟲油茶象甲（Curculio chinensis）的發(fā)生和危害是造成油茶低產低質的重要原因之一[7]。油茶象甲屬于鞘翅目象甲科，廣泛分布于我國云、貴、桂、浙、湘、贛、粵等油茶主產區(qū)，其蟲態(tài)和危害狀如圖1 所示。油茶象甲成蟲將卵產在油茶幼果的果仁內，卵孵化為幼蟲后，幼蟲蛀食果仁，果仁被食一空，導致油茶果早衰和落果。油茶象甲不僅產卵量較多，平均單頭雌蟲可產卵163 粒，而且為害期長，平均每年發(fā)生危害長達200 天左右[7]。油茶象甲幼蟲隱蔽在油茶果內部蛀食果仁，當油茶果顯示出癥狀時已暴發(fā)成災，而化學藥劑不容易滲透到果實內部，只有加大藥劑使用量才能勉強提高防效。油茶作為木本油料樹種，為社會提供健康營養(yǎng)的食用油料，大量使用化學藥劑勢必將危害人類的身體健康。因此，研究并應用更為安全、高效、無殘留的油茶象甲防治技術勢在必行。

圖1 油茶象甲蟲態(tài)及發(fā)生危害示意Fig. 1 Schematic diagrams of developmental states and its damaging phenomenon of Curculio chinensis

在昆蟲與寄主植物的關系中，昆蟲主要通過密布在觸角上的化學感受器接收和識別植物源氣味進行取食、寄主定位或產卵選擇[8]。利用昆蟲與植物的化學通訊機制進行害蟲的預測預報及防治策略已在農林生產中得到應用：例如馬鈴薯（Solanum tuberosum）拉丁名釋放的揮發(fā)物α-蒎烯、α-石竹烯、β-石竹烯、檸檬烯、月桂烯和煙堿對馬鈴薯塊莖蛾（Phthorimaea operculella）的產卵具有顯著的引誘作用，并依據該特性成功研發(fā)出馬鈴薯塊莖蛾植物源高效引誘劑[9]。目前尚未見有關油茶象甲通過揮發(fā)物定位識別寄主植物的報道，因此，本研究分析了油茶果實揮發(fā)物對油茶象甲的電生理和行為反應，為油茶象甲引誘劑的開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 油茶象甲采集與飼養(yǎng)

于2018 年4—8 月在廣東省韶關市曲江區(qū)小坑林場和樂昌市龍山林場采集油茶象甲。利用油茶象甲成蟲假死性的特征，采用振落法捕捉油茶象甲成蟲。首先在進油茶樹底下平鋪一層白色的細紗網，然后搖晃油茶樹，待油茶象甲掉落到細紗網上，將其放入養(yǎng)蟲籠中并帶回實驗室。飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃、相對濕度80%左右、光周期L:D=12 h:12 h，隔天喂食洗凈的油茶鮮果。

1.2 油茶象甲對油茶果實揮發(fā)物的觸角電位測試

將表面洗凈晾干的油茶果實（贛州油茶，果實長度3～5 cm，寬度2～4 cm）放在色譜純的正己烷中浸泡10 min 收集油茶果實的揮發(fā)性物質，加入正十八烷作為內標，用無水硫酸鈉去除多余水分后，用帶過濾膜的移液器將樣品轉移到2 mL樣品瓶內，并用氮吹儀濃縮到適合的濃度，保存在-20 ℃冰箱內待用。用GC-EAD 方法測試油茶象甲觸角對油茶果實揮發(fā)物的觸角電生理反應。氣相色譜型號為安捷倫7890B，色譜條件為：HP-5 (30 m,0.25 mm 內徑,0.25 μm 膜厚) 毛細管色譜柱，載氣為高純氮氣，進樣口溫度250℃，檢測器280℃，柱箱升溫程序為40 ℃保留3 min、10 ℃/min升至250℃并保留5 min。利用荷蘭Syntech 公司的EAG 昆蟲觸角電位記錄儀測定揮發(fā)物引起昆蟲的觸角電生理反應大小。沿油茶象甲觸角基部將觸角剪下，并在觸角尖部切開0.5 mm，然后將觸角連接到觸角電位儀的兩個蘸有導電膠的電極上。GC 和EAG 的樣品分流比為1:1。采用手動不分流進樣模式進樣1 μL，測試油茶象甲的觸角電位反應。每次實驗重復5 根觸角以上。

1.3 活性揮發(fā)物的鑒定

用安捷倫氣相質譜（GC-MS：7890B-5977B）對油茶果實中對油茶象甲具有電生理活性的揮發(fā)物進行鑒定。GC 的進樣口溫度、升溫條件、色譜柱規(guī)格、柱流量等色譜條件和GC-EAD 實驗中的相同，進樣分流比為30:1。MS 條件為：傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，離子掃描范圍50～300。根據NIST17 普庫中的特征離子片段對化合物進行鑒定，同時購買標準品對鑒定結果進行確認。

1.4 油茶象甲對活性揮發(fā)物的行為反應測試

利用Y 型嗅覺儀測試單頭油茶象甲對鑒定的揮發(fā)物的行為反應。在實驗中，分別測試雌油茶象甲對0.1、1、10 和100 ng/μL 正十八烷和油酸酰胺（溶于正己烷當中）的反應。實驗過程中，在Y 型嗅覺儀的一個臂中加入蘸有活性物質的濾紙作為處理，另一臂中加入蘸有正己烷的濾紙作為對照。實驗過程中保持氣流流速為1.2 L/min。雌蟲放入Y 型管中觀察5 min，當雌蟲進入Y 型管一側超過3 cm 且停留時間超過1 min 則記為一個有效選擇。實驗過程中只統(tǒng)計有效選擇的蟲數(shù)。在進行5 個有效重復后，將裝置拆解開用酒精進行沖洗并烘干，然后再進行重復實驗，每組實驗記錄20 個有效重復。實驗中將整個裝置用不透光的黑布罩住，防止光源對實蠅的選擇造成影響。

1.5 數(shù)據分析

利用SPSS (version 20) 中的卡方檢驗(P＜0.05) 分析Y 型嗅覺儀中處理與對照間差異。

2 結果與分析

2.1 油茶果實中對油茶象甲具有生理活性揮發(fā)物的篩選和鑒定

GC-EAD 實驗結果表明，在15.05、19.30、21.97 和22.79 min 4 個出峰時間點，揮發(fā)物能夠引起油茶象甲較強的觸角電生理反應（圖2）。因此，將這4 個物質作為備選活性物質。通過GC-MS 分析和NIST 譜庫比對發(fā)現(xiàn)，在15.05 min 出峰時間的物質，判定為正十八烷，在19.30 min 出峰的物質判定為油酸酰胺，另外兩個出峰時間的物質由于比對相似性較低，暫時無法鑒定。正十八烷和油酸酰胺標準品的GC 出峰時間分別為15.04 和19.28 min，和GC-EAD 中測試的出峰時間基本一致。通過GC-MS 質譜圖比較分析，確定這兩個時間出峰的物質為正十八烷和油酸酰胺（圖3）。

圖2 油茶果實揮發(fā)物對油茶象甲的觸角GC-EAD 反應圖Fig. 2 Electroantennogram of antennae of Curculio chinensis to volatiles of Camellia oleifera fruits

圖3 對油茶象甲具有電生理活性的兩種揮發(fā)物（a 正十八烷；b 油酸酰胺）的質譜圖Fig. 3 Mass spectrograms of (a) n-Octadecane and (b) Oleamide that induce antennae response of Curculio chinensis

2.2 油茶象甲對不同濃度活性揮發(fā)物的行為選擇

Y 型嗅覺儀選擇實驗結果表明，0.1 和1 ng/μL的正十八烷對油茶象甲具有較強的驅避作用（0.1 ng/μL:c2=9.29，P=0.007;1 ng/μL:c2=14.23，P＜0.001），但是油茶象甲對10 ng/μL 和100 ng/μL 濃度的十八烷沒有顯著趨性（P＞0.05,圖4）。1 ng/μL的油酸酰胺對油茶象甲具有較強的吸引作用（c2=15.52，P＜0.001），其它3 個濃度多油茶象甲無顯著引誘作用（P＞0.05,圖4）。

圖4 油茶象甲對不同濃度正十八烷和油酸酰胺的選擇行為Fig. 4 Selection of Curculio chinensis to different concentration of n-Octadecane and Oleamide

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)油茶果實中有4 種化合物能夠引起油茶象甲的觸角電生理反應，通過GC-MS 分析和購買標準品，確定了其中兩種化合物正十八烷和油酸酰胺。本研究首次報道了油茶果實揮發(fā)物和油茶象甲選擇行為之間的關系，對進一步認識油茶象甲蟲對寄主進行取食產卵的行為具有重要意義。

研究結果表明，中濃度的油酸酰胺對油茶象甲產卵具有引誘效果，而在低濃度和高濃度下這種引誘效果減弱或消失，這說明油茶象甲對油酸酰胺的嗅覺反應強弱取決于化合物濃度大小。這種揮發(fā)物對昆蟲行為的濃度劑量效應在其它昆蟲中也有報道。例如，低濃度的β-石竹烯能夠引誘斑翅果蠅（Drosophila suzukii）雌成蟲進行產卵，而高濃度下則表現(xiàn)為產卵驅避效果，并且隨著濃度升高，斑翅果蠅的產卵量逐漸降低[10]。已有研究表明許多植物的揮發(fā)物中含有油酸酰胺，例如金線蘭（Anoectochilus roxburghii）、燕麥（Avena sativa）、虎舌紅（Ardisia mamillata）、茭白（Zizania latifolia）等[11-14]，表明油酸酰胺是一類廣泛存在植物當中的揮發(fā)物，可能對多種昆蟲具有一定的生理活性。

有研究報道瓜蚜（Aphis gossypii）為害黃瓜后會誘導植株釋放正十八烷[15]，被黑條矮縮病毒危害的稻株會誘導釋放出正十八烷[16]。然而，這些蟲害或者病害誘導釋放的揮發(fā)物是否能夠驅避害蟲繼續(xù)為害或者引誘害蟲天敵，目前還不清楚。本研究中的中低濃度正十八烷對油茶象甲具有較強的驅避作用，說明正十八烷可能是植物用來防御害蟲取食危害的一種手段。由于本研究中是用正己烷浸提的辦法提取化合物，因此，油菜果實在蟲害或機械損傷下能否誘導還不清楚。因此，在接下來的研究中，將探索更合適的方法，例如通過固相微萃取等技術，比較研究油茶在健康、蟲害及機械損傷等條件下的揮發(fā)物差異。

在通過調控昆蟲行為進行害蟲防治的方法中有一種叫做推拉策略，“推”是指在林地或作物田內，利用行為驅避劑驅離害蟲；“拉”是指在林地外緣或作物田邊，利用害蟲引誘劑吸引害蟲，并將害蟲集中消滅[17]。油茶象甲對不同濃度正十八烷和油酸酰胺表現(xiàn)出的驅避和引誘的不同行為反應則為利用推拉策略防治油茶象甲提供了一種新的思路，但該推拉策略還需要進一步野外實驗驗證。