胡柳楊，韓 冰 綜述,曹東林 審校

廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510317

當(dāng)今感染性疾病仍是引起人類(lèi)死亡的主要原因，開(kāi)展病原微生物的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)對(duì)疾病的治療和預(yù)后尤為重要。目前，臨床上主要使用的呼吸道病原體檢測(cè)方法包括顯微鏡檢查、細(xì)菌培養(yǎng)和免疫學(xué)試驗(yàn)，這些方法操作過(guò)程煩瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，具有一定技術(shù)難度，靈敏度較低。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，DNA G+C mol%測(cè)定、特異探針雜交技術(shù)、PCR技術(shù)擴(kuò)增特異核酸片段、16SrRNA序列分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析及生物芯片等技術(shù)被應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)，這些方法的靈敏度和特異度高，并且能做到快速檢測(cè)，但都依賴(lài)于昂貴的儀器設(shè)備及經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，這使其在小型社區(qū)醫(yī)院及偏遠(yuǎn)地區(qū)的應(yīng)用受到限制。生物傳感器技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的病原微生物檢測(cè)方法，具有快速、靈敏、成本低、易于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，用于病原體檢測(cè)的主要有免疫傳感器和DNA生物傳感器[1]。其中DNA生物傳感器可以特異性地識(shí)別病原微生物的特異核酸序列，已受到越來(lái)越多的關(guān)注。DNA生物傳感器的一般原理包括將DNA探針固定在傳感器表面，通過(guò)電化學(xué)[2]、光學(xué)[3]或重量法[4]進(jìn)行雜交和檢測(cè)。越來(lái)越多的DNA生物傳感器被設(shè)計(jì)用于病原微生物的即時(shí)診斷，試紙型生物傳感器——基于紙張的微流體生物測(cè)定幾乎符合即時(shí)診斷設(shè)備的所有關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)[5]，即不需要復(fù)雜的設(shè)備、試劑或電源，靈敏且準(zhǔn)確測(cè)定，并且檢測(cè)快速、成本低，易于使用和運(yùn)輸。本文闡述了試紙型生物傳感器的工作原理、應(yīng)用研究和最新進(jìn)展，并探討其在病原微生物現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中所面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展趨勢(shì)。

1 試紙型生物傳感器的原理

1.1試紙型免疫生物傳感器 試紙型免疫生物傳感器[6]的試紙條依次由樣品墊、綴合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成，硝酸纖維素膜和吸收墊以重疊方式附著在塑料背襯上，以促進(jìn)毛細(xì)管流動(dòng)。試紙型免疫生物傳感器各組成部分的作用分別為[6]：塑料背襯提供穩(wěn)定性和黏合性；硝酸纖維素膜分別固定單克隆抗體和多克隆二抗，用于測(cè)試和對(duì)照；硝酸纖維素膜的一端是吸收墊，其與硝酸纖維素膜部分重疊，為毛細(xì)管流動(dòng)提供驅(qū)動(dòng)力；試紙條的最前端是樣品墊；在樣品施加端末放置綴合墊，由纖維素制成并用信號(hào)發(fā)生基團(tuán)標(biāo)記的特異性多克隆抗體處理。該生物傳感器由檢測(cè)線(xiàn)、對(duì)照線(xiàn)和控制線(xiàn)3部分組成，試紙條上的條帶顏色取決于信號(hào)發(fā)生基團(tuán)的顏色。目前試紙型免疫生物傳感器多數(shù)以納米金粒子作為信號(hào)發(fā)生器，納米金粒子在520 nm處有等離子體共振峰，表現(xiàn)為特征性紅色。待測(cè)樣品在樣品墊被加載，然后經(jīng)毛細(xì)管作用沿著條帶移動(dòng)，并在最后的吸收墊處被收集，樣品移動(dòng)到綴合墊時(shí)，待測(cè)物質(zhì)與多克隆抗體結(jié)合形成待測(cè)物質(zhì)-信號(hào)基團(tuán)-多克隆抗體復(fù)合物，當(dāng)樣品移動(dòng)到測(cè)試區(qū)時(shí)，特異性的單克隆抗體捕獲待測(cè)物質(zhì)-信號(hào)基團(tuán)-多克隆抗體復(fù)合物，信號(hào)基團(tuán)在檢測(cè)線(xiàn)中累積，呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的條帶，條帶顏色的強(qiáng)弱與待測(cè)物質(zhì)的含量呈正比。在測(cè)試區(qū)捕獲復(fù)合物后，未結(jié)合的成分(包括過(guò)量的信號(hào)基團(tuán)-多克隆抗體)和流體部分繼續(xù)沿著條帶流動(dòng)，通過(guò)多克隆二抗在對(duì)照區(qū)捕獲未結(jié)合的信號(hào)基團(tuán)-多克隆抗體顯色。控制線(xiàn)始終顯色，以保證試紙型生物傳感器的正常功能。

1.2試紙型DNA生物傳感器 試紙型DNA生物傳感器的試紙條組成與試紙型免疫生物傳感器大致相同，但不同于試紙型免疫生物傳感器，試紙型DNA生物傳感器的檢測(cè)不依賴(lài)于抗原-抗體的特異性結(jié)合。試紙型DNA生物傳感器將PCR與生物傳感器組合成一個(gè)系統(tǒng)，作為一種簡(jiǎn)單快速的PCR后分析工具，與瓊脂糖凝膠電泳相比，靈敏度更高，并且檢測(cè)更加簡(jiǎn)單和快速。試紙型DNA生物傳感器的一般原理包括將DNA探針固定在傳感器表面，通常將對(duì)捕獲DNA擴(kuò)增子具有極強(qiáng)親和力的特定寡核苷酸序列或免疫物質(zhì)(例如：半抗原-抗體和半抗原-蛋白質(zhì))作為DNA探針。目前大多數(shù)試紙型DNA生物傳感器通過(guò)使用金納米粒子[7-11]和有色聚苯乙烯微球[9]作為信號(hào)發(fā)生器來(lái)進(jìn)行DNA的顯色檢測(cè)。試紙型DNA生物傳感器不僅可以定性檢測(cè)，還能進(jìn)行半定量分析，定量數(shù)據(jù)可以通過(guò)儀器進(jìn)行強(qiáng)度讀數(shù)或通過(guò)與酶[8]、熒光染料[12-13]或放射性偶聯(lián)物[14]的額外偶聯(lián)來(lái)記錄。試紙型DNA生物傳感器分為檢測(cè)區(qū)、對(duì)照區(qū)和控制區(qū)3個(gè)部分，傳感器表面的探針結(jié)合擴(kuò)增的DNA，信號(hào)發(fā)生基團(tuán)在檢測(cè)區(qū)累積，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的條帶，當(dāng)在低于飽和濃度的分析范圍內(nèi)測(cè)試DNA產(chǎn)物的量時(shí)，強(qiáng)度與靶DNA的量呈正相關(guān)，從而提供了靶DNA的定量信息[7]。

2 試紙型生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)

試紙型生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)：(1)大部分DNA生物傳感器需要使用儀器，并且在大多數(shù)情況下，涉及幾個(gè)孵育和洗滌步驟。試紙型DNA生物傳感器不需要復(fù)雜的設(shè)備、試劑或電源，無(wú)須使用儀器即可直觀(guān)檢測(cè)DNA。此外，試紙型生物傳感器無(wú)須多次孵育和洗滌，并最大限度地降低對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的要求。(2)具有良好的靈敏度和特異度。YETISEN等[5]證實(shí)試紙型DNA生物傳感器對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)靈敏度是溴化乙啶電泳的50倍及以上，并且高于普通雜交。(3)試紙型生物傳感器可運(yùn)行在多重反應(yīng)系統(tǒng)上。試紙型免疫生物傳感器可以根據(jù)不同的需求在一個(gè)條帶上固定不同病原微生物的特異性抗體，實(shí)現(xiàn)病原體的多重檢測(cè)；試紙型DNA生物傳感器可以在一個(gè)條帶中檢測(cè)到多個(gè)擴(kuò)增的靶基因DNA片段，不同探針?lè)謩e用寡核苷酸或免疫物質(zhì)(例如：半抗原-抗體和半抗原-蛋白質(zhì))標(biāo)記，在臨床使用時(shí)，可根據(jù)不同需求，選擇特殊組合的探針，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化核酸檢測(cè)。(4)檢測(cè)快速、體積小巧、一次性檢測(cè)、檢測(cè)成本低、易于使用和運(yùn)輸。試紙型免疫生物傳感器無(wú)須對(duì)樣品進(jìn)行任何預(yù)處理，樣品點(diǎn)樣后5 min內(nèi)完成檢測(cè)[6]；試紙型DNA生物傳感器在PCR擴(kuò)增后15 min內(nèi)可得到結(jié)果[7-9]。這些特性使得它更適用于在檢驗(yàn)設(shè)備缺乏的小型實(shí)驗(yàn)室和需要快速檢測(cè)的現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)。

3 試紙型生物傳感器在微生物病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

試紙型生物傳感器平臺(tái)可根據(jù)不同需求進(jìn)行相應(yīng)的構(gòu)建，可對(duì)不同的病原體進(jìn)行多重、快速、準(zhǔn)確、可視化檢測(cè)，在病原微生物及抗菌藥物耐藥分析中具有巨大的應(yīng)用潛力?，F(xiàn)將試紙型生物傳感器在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用總結(jié)如下。

3.1病毒性病原體的檢測(cè) LILES等[15]應(yīng)用試紙型生物傳感器檢測(cè)登革病毒并評(píng)估其檢測(cè)的靈敏度和特異度，該方法在檢測(cè)登革熱感染方面比Taqman RT-PCR更敏感，證實(shí)了這種方法也適用于使用反轉(zhuǎn)錄DNA模板檢測(cè)登革病毒。KOIWAI等[16]基于試紙型DNA生物傳感器建立了一種同時(shí)對(duì)3種常見(jiàn)的病毒(包括感染性肌壞死病毒、桃拉綜合征病毒和黃頭病毒)進(jìn)行快速檢測(cè)的新方法，這3種病毒中的每種病毒均具有與常規(guī)PCR相同的靈敏度，且能產(chǎn)生更清晰的顯色結(jié)果并且能夠1次檢測(cè)3種病毒。試紙型DNA生物傳感器被應(yīng)用于篩查、確定宮頸癌標(biāo)本中是否存在人乳頭瘤病毒16型(HPV16)，測(cè)試結(jié)果與這些癌癥的表征匹配率為100%[14]。GLYNOU等[7]應(yīng)用寡核苷酸功能化金納米粒子作為干試劑條帶生物傳感器中的探針用于DNA雜交分析，并檢測(cè)來(lái)自人血漿的丙型肝炎病毒RNA的RT-PCR產(chǎn)物，檢測(cè)效率比瓊脂糖凝膠電泳高8倍，該研究者發(fā)現(xiàn)條帶傳感器對(duì)靶DNA的檢測(cè)明顯更快，與瓊脂糖凝膠電泳和其他技術(shù)檢測(cè)所需的時(shí)間相比更短，僅需10 min。

3.2細(xì)菌性病原體的檢測(cè) 試紙型DNA生物傳感器被應(yīng)用于檢測(cè)食源性病原體霍亂弧菌。在一項(xiàng)對(duì)174株霍亂弧菌和非霍亂弧菌進(jìn)行臨床評(píng)估的研究中，與常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳DNA檢測(cè)相比，試紙型DNA生物傳感器的靈敏度和特異度均為100%[9]，證明它是瓊脂糖凝膠電泳分析的可行替代品，易于使用，且能一次性使用，不需要任何專(zhuān)門(mén)的設(shè)備且無(wú)須使用致癌化學(xué)品。ANG等[10]建立了新型序列特異性核酸側(cè)向流動(dòng)試紙型生物傳感器，用于檢測(cè)引起腹瀉的產(chǎn)毒性霍亂弧菌的霍亂毒素基因，并且在幾分鐘內(nèi)得到快速的顯色結(jié)果，而無(wú)須在高溫下多次洗滌或孵育。KALOGIANNI等[11]建立了能同時(shí)檢測(cè)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的雙色試紙型DNA生物傳感器，該傳感器能夠較為快速地實(shí)現(xiàn)對(duì)這兩種常見(jiàn)細(xì)菌的檢測(cè)。LI等[6]描述了能用于銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌特異性檢測(cè)的多重免疫傳感器的制造過(guò)程和測(cè)試結(jié)果。目前的即時(shí)檢測(cè)平臺(tái)都不能同時(shí)檢測(cè)多重細(xì)菌，但該試紙型免疫生物傳感器可用于快速檢測(cè)多重細(xì)菌的感染因子，對(duì)于每種測(cè)試的感染因子，傳感器都顯示出了高特異性和500～5 000 CFU/mL的檢測(cè)范圍。 HAYASHI等[17]用試紙型DNA生物傳感器實(shí)現(xiàn)了包括腸道沙門(mén)菌、志賀菌、腸侵襲性大腸埃希菌和腸出血性大腸埃希菌在內(nèi)的4種食源性病原體的快速篩查，能夠幫助確認(rèn)安全的食品進(jìn)入市場(chǎng)。TIAN等[18]建立了能夠多重檢測(cè)口腔微生物群的試紙型DNA生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)口腔常見(jiàn)微生物的五重分析，并對(duì)其進(jìn)行了半定量分析。接著，該研究者應(yīng)用試紙型DNA生物傳感器多重分析了口腔斑塊中與齲齒相關(guān)的常見(jiàn)細(xì)菌的五元亞群[19]，表明該一次性試紙型DNA生物傳感器在分析口腔微生物組成以及微生物亞群的即時(shí)診斷方面具有巨大潛力。試紙型DNA生物傳感器可用于細(xì)菌性鼻竇炎相關(guān)細(xì)菌的檢測(cè)[20]，改進(jìn)該傳感器對(duì)細(xì)菌性鼻竇炎和支氣管炎的診斷具有潛在價(jià)值。在過(guò)去30年中，細(xì)菌變異、抗菌藥物的不合理使用以及感染控制方面的問(wèn)題，導(dǎo)致耐藥菌株的增加和播散，SHANMUGAKANI等[21]建立了一種能直接在糞便標(biāo)本中多重檢測(cè)碳青霉烯酶基因的試紙型DNA生物傳感器平臺(tái)，能在2 h內(nèi)直接在糞便標(biāo)本中多重檢測(cè)blaNDM、blaKPC、blaIMP 和blaOXA-48等碳青霉烯酶基因。因此，試紙型DNA生物傳感器是可以應(yīng)用于耐藥基因檢測(cè)的一種價(jià)格合理、快速的即時(shí)檢測(cè)工具。OHSHIRO等[22]開(kāi)發(fā)了一種快速的試紙型PCR-DNA生物傳感器用于鑒定陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中的金黃色葡萄球菌和抗菌藥物耐藥基因mecA和blaZ，整個(gè)過(guò)程可在1 h內(nèi)完成。由于該方法與常規(guī)PCR方法相比，非?？焖俸秃?jiǎn)便，并且與實(shí)時(shí)PCR或全自動(dòng)裝置相比，更為經(jīng)濟(jì)，證實(shí)其所提出的試紙型DNA生物傳感器技術(shù)可應(yīng)用于快速診斷甚至應(yīng)用于社區(qū)醫(yī)院等檢測(cè)儀器缺乏的地方。

4 試紙型生物傳感器技術(shù)的前景展望

試紙型生物傳感器技術(shù)平臺(tái)為臨床診斷中的多重分析及標(biāo)本半定量分析提供了簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)手段。由于試紙型生物傳感器小型化、便攜、檢測(cè)成本低、無(wú)須孵化和洗滌步驟、快速且靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，試紙型生物傳感器已被用于種植業(yè)[23]、水產(chǎn)業(yè)[16,24]、食品安全[17]、醫(yī)療衛(wèi)生[18-19]等領(lǐng)域。

目前試紙型生物傳感器在病原體檢測(cè)方面的研究仍處于初期階段，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究相對(duì)較少，用于臨床檢測(cè)也有一定的局限性，主要包括：(1)試紙型生物傳感器測(cè)定細(xì)菌僅提供相對(duì)豐度，其不一定能反映細(xì)菌的實(shí)際量；(2)試紙型DNA生物傳感器僅能對(duì)有限物種進(jìn)行分析，因?yàn)樵摲椒ㄒ蕾?lài)于物種特異性引物的PCR擴(kuò)增，而目前與人類(lèi)疾病相關(guān)的微生物序列信息沒(méi)有被完全破解或公布，其應(yīng)用會(huì)受到一定的限制；(3)試紙型生物傳感器檢測(cè)到的細(xì)菌可能并不直接參與疾病的發(fā)?。?4)試紙型DNA生物傳感器多重檢測(cè)平臺(tái)的建立要克服多重PCR的難題，因此較難實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。隨著試紙型生物傳感器信號(hào)處理技術(shù)、探針技術(shù)以及多重PCR技術(shù)研究的不斷深入，試紙型生物傳感器在醫(yī)療設(shè)備不齊全的社區(qū)醫(yī)院、偏遠(yuǎn)地區(qū)醫(yī)院，以及在基因分型、病原微生物檢測(cè)等方面將有著較好的應(yīng)用前景。同時(shí)可以預(yù)見(jiàn)，試紙型生物傳感器在現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)方面也將有著廣泛的應(yīng)用前景。

5 小 結(jié)

綜上所述，試紙型生物傳感器不需要復(fù)雜的設(shè)備、試劑或電源，具有良好的靈敏度和特異度，并且檢測(cè)快速、體積小巧、檢測(cè)成本低、易于使用和運(yùn)輸，是適用于小型實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)呼吸道病原體的理想平臺(tái)。