王乙

（長春中醫(yī)藥大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院，吉林 長春 130021）

下腰部疼痛是目前骨科門診中最常見且頻發(fā)的健康問題之一。全球超過80%的成年人曾有過下腰部疼痛的病史［1］，且長期的下腰部疼痛最終會導(dǎo)致殘疾并帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究［2］顯示：椎間盤退變是導(dǎo)致下腰部疼痛主要病因。椎間盤退變時椎間盤組織內(nèi)的基質(zhì)蛋白和水含量急劇下降，導(dǎo)致纖維環(huán)組織強(qiáng)度減弱，髓核在壓力作用下從薄弱的纖維環(huán)處突出，通過機(jī)械壓迫、化學(xué)刺激和炎癥反應(yīng)等方式刺激神經(jīng)根，引發(fā)坐骨神經(jīng)痛等癥狀［3］。目前，針對椎間盤退變病因的研究已深入至分子生物學(xué)水平，椎間盤退變與椎間盤細(xì)胞流失、細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡和局部炎癥反應(yīng)有密切關(guān)聯(lián)。而多種生長因子在維持椎間盤代謝穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用，其中轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）被證實(shí)在椎間盤退變分子生物學(xué)進(jìn)程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用［4］。但目前尚無系統(tǒng)性綜述回顧TGF-β 通路在椎間盤退變分子生物學(xué)進(jìn)程中的作用機(jī)制。結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，本文作者首次總結(jié)了椎間盤退變中TGF-β 表達(dá)差異和下游通路情況，并回顧了TGF-β 抑制類藥物對于椎間盤退變的研究進(jìn)展，旨在分析TGF-β 通路在椎間盤退變中的作用機(jī)制及通過調(diào)控TGF-β 通路對椎間盤退變的治療情況。

1 TGF-β 通路

哺乳動物體內(nèi)，TGF-β 家族包括TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β33 個成員，雖然其分子結(jié)構(gòu)高度相似，但因表達(dá)順序和激活狀態(tài)的差異，導(dǎo)致其發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能［5］。所有的TGF-β 成員初始均表達(dá)為非活性的前體狀態(tài)，由一條潛在相關(guān)多肽和一條成熟多肽鏈連接而成。TGF-β 通過潛在相關(guān)多肽和TGF-β 結(jié)合蛋白連接的二硫鍵穩(wěn)定維持在細(xì)胞外基質(zhì)中。而在椎間盤中，持續(xù)的負(fù)荷刺激通過整合素-10 將力學(xué)信號轉(zhuǎn)化傳遞為化學(xué)信號，促進(jìn)TGF-β 的活化和釋放?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和活化氧等因子也參與了TGF-β 的激活［6］。

在TGF-β 激活過程中，成熟多肽鏈轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬Ψ肿淤|(zhì)量為25 000 的二聚體作為與細(xì)胞表面TGF-β 受體復(fù)合物連接的配體，參與TGF-β 的激活。TGF-β 受體復(fù)合物是由一對跨膜的TGF-βI型受體（TβRIs）和一對TGF-βⅡ型受體（TβRⅡs）組成的具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的四聚體［7］。在四聚體形成初期，TGF-β 配體與TβRⅡs 結(jié)合，并在特定的絲氨酸和蘇氨酸殘基上使膜旁區(qū)TβRIs的甘氨酸-絲氨酸結(jié)構(gòu)域發(fā)生反式磷酸化。TβRIs也被稱為激活素受體樣激酶（activin receptor-like kinases，ALKs），在經(jīng)典信號通路中，激活的ALK5 在絲氨酸羧基端將SMAD2 和SMAD3 磷酸化，同時激活的R-SMADs 與SMAD4 形成三聚體復(fù)合物，而此三聚體復(fù)合物轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，通過刺激或抑制靶基因表達(dá)發(fā)揮功能［8］。而TβRIs 包含ALK1 和ALK5 2 種不同的結(jié)構(gòu)類型，激活的ALK1 調(diào)節(jié)SMAD1/5/8 磷酸化，而磷酸化的SMAD1/5/8 與SMAD2/3 在組織中常發(fā)揮相反的生理功能。此外，TGF-β 還可以激活非SMAD 依賴的非經(jīng)典信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路等，以發(fā)揮特異生理學(xué)功能［9］。

2 TGF-β 在椎間盤發(fā)育中的作用

椎間盤由生骨結(jié)和脊索中的細(xì)胞發(fā)育而來。在胚胎第10 周時，脊索外部體節(jié)細(xì)胞開始分化，形成梭形的纖維母細(xì)胞，隨后發(fā)育成為纖維環(huán)組織。而在胚胎第18 周時，中胚層脊索組織逐漸發(fā)生黏液化，最終形成髓核組織［10］。在胚胎期，TGF-β參與椎間盤發(fā)育中的脊索基質(zhì)調(diào)控，并誘導(dǎo)體結(jié)分化形成纖維環(huán)細(xì)胞［11］。研究［12］表明：靶向敲除TβRⅡs 的Col2a1-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠會導(dǎo)致椎間盤發(fā)育不全，甚至完全缺失。另外，SMAD3 基因敲除鼠中亦可觀察到脊柱后凸畸形，并表現(xiàn)出椎間盤高度、膠原和蛋白多糖含量下降等椎間盤退變表現(xiàn)。PECK 等［13］發(fā)現(xiàn)：小鼠胚胎發(fā)育時從受精卵至胚胎期12.5 d 期間TGF-β 表達(dá)的變化，證實(shí)TGF-β在胚胎發(fā)育階段對椎間盤發(fā)育起到的核心調(diào)節(jié)作用。TGF-β 在出生后小鼠椎間盤發(fā)育過程中也起到關(guān)鍵性作用。通過Col2a1-CreERT2構(gòu)建的T βRⅡCol2ER小鼠特異性地抑制了纖維環(huán)細(xì)胞與脊柱周圍軟骨細(xì)胞中TGF-β 通路的作用。在此轉(zhuǎn)基因鼠出生早期可觀察到其終板發(fā)育不良，終板高度和厚度明顯小于正常小鼠，且MMP-13 等基質(zhì)降解蛋白相關(guān)基因表達(dá)水平明顯升高，提示TGF-β 在椎間盤的形成和發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用［14］。

3 TGF-β 在椎間盤中的表達(dá)

研究［15］表明：TGF-β 和TGF-β 受體的表達(dá)水平隨著年齡及椎間盤退變的進(jìn)展而發(fā)生改變，但不同的研究結(jié)果［16-23］間存在較大差異，甚至得出截然相反的結(jié)論。在衰老小鼠模型中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明：TGF-β 和TGF-β 受體隨著年齡增長而表達(dá)水平降低；與2 月齡鼠比較，18 月齡鼠椎間盤中的pSMAD2/3 的表達(dá)水平亦明顯降低［16］。研究［17］表明：3 歲齡家兔髓核和纖維環(huán)組織內(nèi)TGF-β1 mRNA 表達(dá)水平則明顯低于6 月齡家兔。2～48 周齡大鼠的髓核和纖維環(huán)內(nèi)TGF-β 表達(dá)水平隨年齡增加呈相反的變化趨勢［18］。

在人椎間盤組織內(nèi)，TGF-β 表達(dá)水平情況報(bào)道不一致。NERLICH 等［19］提取了30 具無椎間盤退變的新鮮尸體中的椎間盤組織和12 具有椎間盤退變的尸體中的椎間盤組織，結(jié)果顯示：TGF-β1 表達(dá)與椎間盤退變間存在密切聯(lián)系；后續(xù)研究［20］證實(shí)：TGF-β1 的表達(dá)在退變椎間盤中明顯上調(diào)，并與椎間盤退變病理分型呈正相關(guān)關(guān)系［20］。另外，SCHROEDE 等［21］發(fā)現(xiàn)：TGF-β1在退變椎間盤的髓核中表達(dá)水平降低，而在纖維環(huán)中表達(dá)水平明顯升高。ABBOTT 等［22］觀察顯示：與輕度椎間盤退變比較，在嚴(yán)重退變椎間盤的髓核細(xì)胞內(nèi)TβRI 下調(diào)更加明顯。與正常組織比較，突出髓核中TGF-β1 mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［23］。綜上，椎間盤中TGF-β 的表達(dá)水平隨著物種、年齡、組織和細(xì)胞類型及檢測方法不同存在著較大差異。椎間盤中表達(dá)的TGF-βs 以無生物活性的狀態(tài)為主，而實(shí)際發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的TGF-β通路與組織中TGF-β 表達(dá)量呈不完全相關(guān)。

4 TGF-β 在椎間盤退變中的相關(guān)作用機(jī)制

椎間盤退變的病理學(xué)特征包括細(xì)胞外基質(zhì)含量下降、細(xì)胞流失和炎癥反應(yīng)等。而TGF-β 通路則可通過調(diào)控以上3 個方面對椎間盤退變進(jìn)行修復(fù)。

4.1 抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成椎間盤內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的改變是椎間盤退變重要的標(biāo)志之一，其表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解代謝失衡［24］。退變時，椎間盤中的組織細(xì)胞和炎癥細(xì)胞持續(xù)釋放一系列炎癥因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）等，造成MMPs 和去整合素等分解代謝酶類表達(dá)水平升高［25］。TGF-β 可以通過MAPK 和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路在一定程度上逆轉(zhuǎn)炎癥因子誘導(dǎo)的基質(zhì)降解酶類表達(dá)上調(diào)，起到保護(hù)基質(zhì)的作用［26］。微小RNA（microRNA）通過靶向TGF-β 通路參與椎間盤退變過程中的基質(zhì)降解，而通過TGF-β 調(diào)控microRNA 水平亦成為椎間盤退變治療的新手段［27］。

在抑制基質(zhì)降解的同時，TGF-β 通路還參與促進(jìn)椎間盤中基質(zhì)的合成過程。膠原、蛋白聚糖和糖胺聚糖是椎間盤中3 種重要的基質(zhì)組分［28］。蛋白聚糖能與透明質(zhì)酸結(jié)合形成復(fù)雜三位結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，與蛋白聚糖結(jié)合的糖胺聚糖帶有負(fù)電荷，吸引陽離子在髓核中形成高滲透壓［29］。研究［30］表明：TGF-β SMAD2/3、RHOA/ROCK 和MAPK 等通路刺激糖胺聚糖的合成。在髓核細(xì)胞中，TGF-β則通過促進(jìn)CCN-2 表達(dá)、抑制CCN-3 表達(dá)以誘導(dǎo)蛋白聚糖的分泌［31-32］。此外，在椎間盤退變的器官和動物模型實(shí)驗(yàn)中，TGF-β 可促進(jìn)糖胺聚糖、蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)［33-34］。值得注意的是，用于研究的模型動物均為低齡動物，而TGF-β 對于椎間盤基質(zhì)合成的作用也隨著年齡變化而變化。因此，還需后續(xù)研究TGF-β 在高齡椎間盤退變動物模型中的椎間盤基質(zhì)合成作用。

4.2 促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡在退變的椎間盤中，椎間盤細(xì)胞處于多種復(fù)雜微環(huán)境中，如低氧、力學(xué)負(fù)荷、低pH 值、缺乏養(yǎng)供和高滲透壓等，降低了細(xì)胞活性，并可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［35］。研究［36-37］表明：TGF-β1 能上調(diào)纖維環(huán)細(xì)胞增殖率，并具有刺激多種利于細(xì)胞增殖的生長因子，IGF-1和FGF-2 的協(xié)同作用。在小鼠髓核細(xì)胞中，外源性給予TGF-β1 能夠通過調(diào)控c-Myc 和MAPK 通路影響細(xì)胞周期以增高細(xì)胞增殖率［38］。研究［39］顯示：SMAD 能夠通過抑制Wnt/β -連環(huán)蛋白（β-catenin）通路來維持高鉀狀態(tài)下大鼠髓核細(xì)胞的增殖。

TGF-β 除能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖外，還具有緩解細(xì)胞凋亡和延遲椎間盤退變的作用［40］。細(xì)胞凋亡和自噬是引起椎間盤退變的關(guān)鍵致病因素之一［41］。TGF-β 則可以通過抑制自噬而減少乏養(yǎng)狀態(tài)下纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和MAPK 則被證實(shí)是抑制纖維環(huán)細(xì)胞凋亡的核心通路［42］。研究［43-44］顯示：受體相互作用蛋白激酶1（RIPK-1）通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是造成髓核細(xì)胞死亡的主要原因，但后續(xù)未進(jìn)行相關(guān)研究以證實(shí)對RIPK-1 信號通路抑制后退變椎間盤中髓核細(xì)胞的存活和凋亡情況。細(xì)胞衰老是椎間盤退變的主要誘因之一，而TGF-β 則是調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老凋亡的重要信號通路，然而，其對椎間盤細(xì)胞衰老調(diào)控作用的機(jī)制尚不清楚，仍有待深入探究。

4.3 抑制炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng)與椎間盤退變的進(jìn)展緊密相關(guān)。退變的椎間盤基質(zhì)會產(chǎn)生多種化學(xué)因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein1，MCP-1）和趨化因子配體4（CCL-4）等，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集于退變椎間盤組織處，廣泛的巨噬細(xì)胞浸潤則會引起炎癥因子的分泌，TNF-α和IL-1β 為其中主要的炎癥因子，并會進(jìn)一步上調(diào)基質(zhì)分解代謝酶，加速椎間盤退變的進(jìn)展速度［45］。TGF-β 的治療則會在抑制TNF-α 和IL-1β 分泌的同時，降低由于炎癥反應(yīng)上調(diào)的MMPs 的表達(dá)，起到抑制炎癥和防止基質(zhì)降解的功能［46］；另一方面，TGF-β 可以通過抑制炎癥因子上游環(huán)節(jié)的表達(dá)而起到抑制炎癥的作用。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphocytic production，TSLP）與IL-7 同源，通過刺激MCP-1 引起巨噬細(xì)胞在退變椎間盤組織的局部募集［47］。內(nèi)源性TGF-β 通過抑制NF-κB 活化而抑制TSLP 的穩(wěn)定表達(dá)。TGF-β可以通過激活MAPK 通路下調(diào)CCL-4 的表達(dá)。因此，活化的TGF-β 通路可以通過抑制炎癥的起始和發(fā)展，進(jìn)而緩解椎間盤退變時的局部炎癥狀態(tài)［48］。

5 過度激活TGF-β 通路導(dǎo)致椎間盤退變加劇

TGF-β 被認(rèn)為是一種多效能細(xì)胞因子，其表達(dá)水平的高低可誘發(fā)不同的疾病狀態(tài)［49］。TGF-β的激活在胚胎發(fā)育和早期腫瘤抑制過程中起到重要作用，但過量表達(dá)的TGF-β 則會引起組織纖維化并促進(jìn)晚期腫瘤的發(fā)展［50］。而TGF-β 劑量相關(guān)性的生理學(xué)作用在關(guān)節(jié)疾病的發(fā)展中也起到重要調(diào)控作用。在健康關(guān)節(jié)軟骨中，TGF-β 處于基本正常表達(dá)狀態(tài)，其通過激活SMAD2/3 通路維持軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)態(tài)。但在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中，由于TGF-β 及其受體表達(dá)異常，TGF-β 的異常激活則會通過SMAD1/5/8 通路促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎［6］。TGF-β 過度表達(dá)會加速椎間盤退變的發(fā)展［51］。在小鼠椎間盤退變模型中，異常機(jī)械負(fù)荷會導(dǎo)致TGF-β 信號過度激活而加速退變速度，而TβRI 抑制劑則通過抑制受體調(diào)節(jié)型SMAD（receplor regulate SMAD，R-SMAD）信號有效抑制椎間盤退變的進(jìn)展［52］。在家兔纖維環(huán)缺損模型中，通過注射TGF-β 抑制劑氟尿嘧啶可以有效延緩纖維環(huán)的退變速度［53］。在牛髓核細(xì)胞退變過程中，TGF-β 同時激活SMAD2/3 和SMAD1/5/8 正反2 條通路，而激活的SMAD1/5/8 對SMAD2/3 具有負(fù)調(diào)控作用，可導(dǎo)致椎間盤進(jìn)一步的退變［54］。而在人軟骨細(xì)胞中則驗(yàn)證了ALK1 依賴的SMAD1/5/8 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以抑制TGF-β/ALK5 依賴的SMAD3 的轉(zhuǎn)錄活性，可解釋為不同劑量TGF-β 造成了R-SMAD 的差異性激活所致［55］。

盡管上述研究結(jié)果提示TGF-β 通路的異常激活可能是椎間盤退變的原因之一，但其證據(jù)仍不充足。首先，研究對象主要針對鼠和兔等實(shí)驗(yàn)動物，而針對人類椎間盤組織中TGF-β 對椎間盤退變的影響仍缺少相關(guān)研究證據(jù)；其次，TGF-β 通路的表達(dá)水平和R-SMAD 的激活隨年齡和椎間盤退變的進(jìn)展而發(fā)生變化，但目前TGF-β 對椎間盤退變影響的相關(guān)研究模型主要為機(jī)械暴力所致，而非年齡老化所致。因此，在后續(xù)研究中有必要探究不同年齡階段和不同椎間盤退變階段個體中TGF-β 表達(dá)情況對疾病進(jìn)展的作用；最后，TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在椎間盤退變中的不良反應(yīng)作用機(jī)制仍不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

6 TGF-β 通路用于椎間盤退變治療的前景

目前，椎間盤退變的TGF-β 通路療法大致可分為以下幾種策略：①激活的TGF-β 通路直接增加細(xì)胞外基質(zhì)沉積、抑制細(xì)胞流失和炎癥反應(yīng)，直接修復(fù)退變的椎間盤；②利用TGF-β 通路與組織工程學(xué)手段相結(jié)合，用以間接修復(fù)退變的椎間盤。一方面，TGF-β 可與其他細(xì)胞因子發(fā)揮協(xié)同作用，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為髓核樣細(xì)胞，增加椎間盤成熟細(xì)胞數(shù)量，緩解椎間盤退變的速度［56］；為進(jìn)一步驗(yàn)證分化的髓核樣細(xì)胞生理特性和功能，需針對間充質(zhì)干細(xì)胞分化而成的髓核樣細(xì)胞進(jìn)行表型檢測［57］。另一方面，TGF-β 介導(dǎo)了間充質(zhì)干細(xì)胞和髓核細(xì)胞間的信息傳遞，其利于椎間盤細(xì)胞的表型穩(wěn)定，并促進(jìn)退變椎間盤的再修復(fù)［58］。此外，隨著可注射型水凝膠和自組裝肽支架等多種組織工程生物材料等迅速發(fā)展，將TGF-β 與上述材料進(jìn)行復(fù)合可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子的緩釋，避免了TGF-β 爆發(fā)性釋放造成的局部毒性效應(yīng)，并可長期發(fā)揮對間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，有效驅(qū)動間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的椎間盤再生［59］。然而，TGF-β 信號的過度激活已被證明會加速椎間盤的退化，因此，TGF-β 信號的適度激活是椎間盤治療的關(guān)鍵。抑制TGF-β 的異常表達(dá)也是一種治療椎間盤退變有效的手段。局部應(yīng)用TGF-β 抑制劑治療椎間盤退變具有較大研究潛力，但仍需要對給藥劑量、給藥時間和給藥方法等具體問題進(jìn)行探索篩選，開發(fā)出一套適合TGF-β 的抑制給藥系統(tǒng)以緩解TGF-β 過度表達(dá)對椎間盤的破壞。

7 總結(jié)

TGF-β 信號在椎間盤的發(fā)育、生長和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控中均起到重要作用。TGF-β 信號的激活對椎間盤退變具有良好的治療前景，但過度激活TGF-β 信號則會導(dǎo)致椎間盤的破壞，加速退變的進(jìn)程。因此，后續(xù)研究還需進(jìn)一步探究椎間盤退變的不同疾病進(jìn)程階段TGF-β 信號的表達(dá)情況和相應(yīng)分子機(jī)制，只有深入理解TGF-β 信號對椎間盤退變的作用機(jī)制，才能安全有效地實(shí)現(xiàn)TGF-β 治療椎間盤退變的臨床轉(zhuǎn)化。