楊 爍，溫 寧

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 100853

近年來，以干細胞為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)在骨缺損修復(fù)與再生領(lǐng)域中展現(xiàn)了良好的修復(fù)效果以及廣闊的應(yīng)用前景。但是干細胞治療的局限性也受到越來越多的關(guān)注，如倫理限制、免疫排斥反應(yīng)、突變致瘤性等[1]。最近的研究表明外泌體具有與其來源細胞相似的生物學(xué)效應(yīng)，可以作為間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)的替代物應(yīng)用于骨組織修復(fù)，從而規(guī)避直接使用干細胞帶來的風(fēng)險，實現(xiàn)“無細胞治療”[2]。另外，外泌體也可介導(dǎo)細胞間通訊，在骨疾病的發(fā)生、發(fā)展以及診斷中扮演重要角色[3]。本文就外泌體在骨再生及骨疾病領(lǐng)域的研究做一綜述，以期為外泌體的臨床應(yīng)用提供參考。

1 外泌體對骨缺損修復(fù)與再生作用

外泌體是細胞囊泡的一種，最早于1983年在網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，并在1987年被命名為“exosome”[4]。外泌體的直徑為30 ～ 150 nm，可由多種細胞(如間充質(zhì)干細胞、樹突狀細胞、上皮細胞、脂肪細胞、B細胞)所分泌并廣泛存在于血液、尿液、唾液等體液中[5]。外泌體的結(jié)構(gòu)主要是磷脂雙分子層及其所包含的內(nèi)容物如mRNA、miRNA、DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等[6]。外泌體可以將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)運至靶細胞，從而發(fā)揮細胞間通訊的作用，同時影響細胞的微環(huán)境并調(diào)節(jié)細胞相應(yīng)的生理功能。目前的研究表明，外泌體不但能參與組織的修復(fù)再生，還在疾病診斷、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)以及藥物靶向運輸?shù)阮I(lǐng)域發(fā)揮作用[7]。

骨重建是維持骨代謝平衡的關(guān)鍵。在骨重建中涉及到許多與骨相關(guān)的細胞，如骨髓間充質(zhì)干細胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨細胞、破骨細胞以及骨細胞[8]。除了骨相關(guān)細胞，其他細胞系統(tǒng)如免疫細胞(T細胞，樹突細胞和單核細胞)以及血管內(nèi)皮細胞在骨重建中同樣發(fā)揮重要作用[9]。鑒于骨重建是一個復(fù)雜的過程，如何控制這些細胞之間的通訊對骨再生是極其重要的環(huán)節(jié)。細胞間通訊的一種途徑是通過細胞間直接接觸來傳遞信號并調(diào)節(jié)相應(yīng)的生理功能，另一種途徑則是通過體液循環(huán)中一些可溶性介質(zhì)來進行信號傳遞[10]。目前的研究表明外泌體在信號傳遞中發(fā)揮重要作用，能夠影響多種細胞的功能來參與骨組織的修復(fù)與再生[11]。

1.1 外泌體促進BMSCs成骨分化 研究表明，外泌體內(nèi)的miRNA在MSC成骨分化的過程中發(fā)揮重要作用。對MSC來源外泌體的miRNA分析表明，在MSC成骨細胞分化過程中9個miRNA(let-7a，miR-199b，miRNA-218，miRNA-148a，miRNA-135b，miRNA-203，miRNA-219，miRNA-299-5p和 miRNA-302b)被 上 調(diào)，5種 miRNA(miR-221，miR-155，miR-885-5p，miR-181a和 miR-320c)被下調(diào)，以上這些miRNA都在成骨分化以及礦化中發(fā)揮作用[12]。Narayanan等[13]提取了經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后BMSCs的外泌體，并將其加入到hBMSCs培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，在2D培養(yǎng)條件下外泌體可以促進BMP9及TGF-β1基因的表達；而在3D培養(yǎng)條件下，外泌體可以促進OCN、RunX2基因的表達。除了BMSCs之外目前還有多種MSC來源的外泌體被證明在BMSCs成骨分化中發(fā)揮作用。如人誘導(dǎo)多能干細 胞 (human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)、人脂肪間充質(zhì)干細胞(human adipose mesenchymal stem cells，hAMSCs)來源的外泌體等[14-15]。

1.2 外泌體調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖和活性 外泌體可以通過調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖和活性來促進骨再生。研究表明，MSC來源的外泌體可以直接被成骨細胞攝入，促進成骨細胞的增殖并誘導(dǎo)GLUT3和MAPK通路相關(guān)蛋白的合成[16]。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)hAMSCs來源的外泌體可以促進人成骨前體細胞的增殖和遷移，并且可以上調(diào)成骨相關(guān)基因Ⅰ型膠原、OPN、RunX2等的表達水平。此外，外泌體還可將miRNA(如miRNA-196a)轉(zhuǎn)運至成骨細胞，并對成骨細胞的增殖和活性產(chǎn)生影響[17]。研究發(fā)現(xiàn)從高度礦化的MC3T3-E1細胞提取的外泌體中有43個miRNA高表達，包括miR-30d-5p、miR-133b-3p和miR-140-3p，這些miRNA在功能上被確定參與調(diào)節(jié)骨組織的重塑過程，并被認為可以通過調(diào)節(jié)Wnt、TGF-β和鈣離子信號通路，參與成骨細胞的分化和多種生理功能[18]。

1.3 外泌體促進細胞外基質(zhì)的礦化 骨再生中骨基質(zhì)礦化是一個十分重要的生理過程。Narayanan等[13]研究發(fā)現(xiàn)MSC來源的外泌體可以直接結(jié)合于細胞外基質(zhì)中的蛋白(如Ⅰ型膠原及纖連蛋白)從而促進細胞外基質(zhì)的礦化。Qi等[14]在體外研究中發(fā)現(xiàn)，hiPSCs來源的外泌體可以促進骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs的增殖，提高其成骨分化過程中ALP活性及Ⅰ型膠原、OPN、RunX2等基因的表達水平，并促進骨基質(zhì)礦化。此外，有研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌細胞來源的外泌體可將人成骨細胞的增殖活性提高1.5倍，提高ALP活性并促使其產(chǎn)生更多的鈣沉積物[19]。

1.4 外泌體促進血管新生 血管新生在骨再生過程中發(fā)揮著重要的生理功能。新生血管不僅可以運送氧氣和重要的營養(yǎng)物質(zhì)，還可以促進細胞增殖及骨基質(zhì)礦化[20]。Zhu等[21]在體外研究中發(fā)現(xiàn)hAMSCs來源的外泌體具有促進血管生成的作用，通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，該外泌體中包含了對血管內(nèi)皮細胞增殖及血管形成有重要調(diào)節(jié)作用的miRNAs(miR-126、miR-130a和miR-132)。在另一項體外研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)人胎盤MSC來源外泌體可以通過促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移來促進血管形成[22]。另外，Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)hiPSCs細胞來源的外泌體可以通過激活PI3K/Akt通路來促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及成血管作用。體內(nèi)研究中，Xie等[24]將大鼠BMSCs來源外泌體與組織工程支架材料結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能夠有效促進骨再生及血管再生。Zhang等[25]將人臍帶間充質(zhì)干細胞來源外泌體用于大鼠骨折模型中觀察其對骨折的愈合效果，結(jié)果表明外泌體能夠通過促進缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長因子的表達來促進血管形成，進而加速骨折愈合。

2 外泌體在骨疾病中的作用

骨形成和骨吸收是維持骨代謝平衡的關(guān)鍵。當這個平衡被打破之后就會發(fā)生很多與骨相關(guān)的疾病。多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種惡性溶骨性骨疾病，它的特征是破骨細胞活性過高和成骨細胞活性不足。骨髓來源的細胞與MM細胞之間的通訊在骨質(zhì)吸收和腫瘤進展中發(fā)揮了重要作用[26]。MM細胞來源的外泌體能夠促進破骨細胞的募集以及破骨活動的進行，同時MM患者的BMSCs來源外泌體能夠促進骨髓瘤的增殖，而健康人來源的BMSCs外泌體則能抑制MM細胞的增殖及血管生成[27]。

骨質(zhì)疏松癥是一種常見而嚴重的疾病，它的特點是骨密度下降，患者骨折風(fēng)險增加。外泌體可以通過影響骨代謝過程而影響骨質(zhì)疏松進程。破骨細胞外泌體中的miR-214-3p能夠影響成骨分化以及骨形成[28]。Yavropoulou等[29]研究發(fā)現(xiàn)骨密度較低的絕經(jīng)后婦女血清中的miR-21-5p水平要低于對照組婦女。此外，在一項研究中學(xué)者發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者以及小鼠血清中破骨細胞來源外泌體的miR-214表達顯著高于正常人及小鼠，該研究發(fā)現(xiàn)miR-214可通過外泌體作用于成骨細胞并抑制其成骨活性[30]。

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)同樣是骨科的一種常見病，它的特征是嚴重的關(guān)節(jié)軟骨退行性變，在女性中非常普遍。OA的早期診斷較難，而且目前針對OA的治療方案也比較有限。滑膜液主要位于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，能夠與關(guān)節(jié)軟骨直接接觸。研究認為滑膜液參與了OA的病理過程[31]。最近的研究已經(jīng)開始關(guān)注滑膜液中外泌體在OA的發(fā)生以及早期診斷中所發(fā)揮的作用。研究表明，當OA患者滑膜液中外泌體被關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)吞后，細胞會低表達與軟骨基質(zhì)形成相關(guān)的基因如蛋白聚糖、Ⅱ型膠原，高表達炎癥相關(guān)基因如IL-6。此外，OA患者外泌體中miRNA的含量也展現(xiàn)出性別特異性。女性患者中有許多與雌激素反應(yīng)相關(guān)的miRNAs，如 miR-181d-3p、miR-185-5p以 及 miR-7107-5p，這也預(yù)示篩查這些性別特異性miRNAs可作為早期診斷OA的途徑[32]。

3 外泌體的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

鑒于外泌體在組織再生以及細胞通訊中的重要作用，其具體應(yīng)用開始受到越來越多的關(guān)注。在骨組織工程中，越來越多的研究開始用外泌體代替間充質(zhì)干細胞來進行骨修復(fù)。相比于直接應(yīng)用干細胞進行治療，外泌體具有以下有點：1)安全性高。外泌體治療可以避免直接應(yīng)用干細胞所產(chǎn)生的突變致瘤、免疫排斥及血管栓塞等并發(fā)癥的風(fēng)險。2)易于運輸及保存。外泌體膜結(jié)構(gòu)能夠保護其內(nèi)容物，在體外-80℃條件下可以長期保存且不損失效力。3)免疫原性低。外泌體可以跨質(zhì)膜運輸，極少發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。4)作用效率高。外泌體可以直接被靶細胞攝入并作用于靶細胞，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[33-34]。Qin等[17]將BMSCs來源的外泌體注射到大鼠顱骨缺損模型中來觀察骨修復(fù)效果，結(jié)果表明顱骨缺損的愈合明顯加快。Qi等[14]將hiPS來源外泌體與β-磷酸三鈣支架材料相復(fù)合用于修復(fù)大鼠顱骨缺損，結(jié)果表明外泌體復(fù)合支架材料組的修復(fù)效果要明顯好于單純的支架材料組，作者通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以通過激活PI3K/Akt信號通路來促進BMSCs體外成骨效果。Li等[35]將聚多巴胺修飾的PLGA材料作為載體負載人脂肪間充質(zhì)干細胞來源的外泌體來進行骨修復(fù)，也取得了不錯的成骨效果。

除了在組織工程中的應(yīng)用，由于在病理狀態(tài)下外泌體內(nèi)容物的表達水平與正常狀態(tài)有所不同，再加上外泌體易于收集且較穩(wěn)定的特點，利用外泌體作為早期骨骼疾病的診斷成為一種可能。外泌體同樣可以被作為一種治療方法用于某些疾病的治療，如當骨質(zhì)疏松患者發(fā)生骨折時，BMSCs來源的外泌體可以通過轉(zhuǎn)運miRNAs(如miR-21、miR-4532及miR-125b-5p)來加速骨折的愈合[36]。此外，由于外泌體具有納米化尺寸、高生物相容性以及與細胞膜特異性結(jié)合的能力，可以把外泌體作為特異性藥物的運輸載體來靶向治療特定疾病。如位于外泌體表面的EphrinA2能夠特異性結(jié)合成骨細胞表面受體，在骨質(zhì)疏松患者中可以通過向外泌體中加載治療藥物如甲狀旁腺激素來調(diào)控患者成骨細胞的功能進而達到治療目的[30]。

盡管外泌體在骨再生及骨相關(guān)疾病的診斷及治療等方面開辟了新的研究領(lǐng)域，但是其具體應(yīng)用中仍有許多問題等待我們?nèi)ソ鉀Q。如何提取高純度的外泌體來保證診斷的準確性以及提高治療效果是目前面臨的難題，目前的提取方法如超速離心、密度梯度離心以及試劑盒法等都不能最大限度地提高外泌體的純度。此外，如何提高外泌體的靶向運輸能力以及提升外泌體的作用效率也是目前外泌體療法應(yīng)用的關(guān)鍵。因此外泌體的臨床應(yīng)用還需要更多的探索。