賈梓淇，王艷宇，王亞東，邴鐘興，梁乃新*，李單青*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 胸外科，北京 100730； 2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 八年制臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，北京 100005)

肺癌(lung cancer)是目前全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，盡管亞洲人群中有25%左右的肺腺癌攜帶意義明確且可治的驅(qū)動基因突變，但絕大多數(shù)晚期肺癌仍屬難治性。目前針對這一群體尚無明確的精準(zhǔn)治療方案，故腫瘤體外功能學(xué)模型成為目前針對難治性肺癌探究腫瘤藥物敏感性的研究熱點(diǎn)。其中，類器官(organoid)是一種從干細(xì)胞增殖而來且微觀下具有自組裝特性的三維體外腫瘤模型，其囊括了原始腫瘤的結(jié)構(gòu)和功能特征，并具有時(shí)效快、 增殖能力強(qiáng)、 可操縱性好等優(yōu)點(diǎn)， 可以用于研

究瘤內(nèi)多細(xì)胞間相互作用、原始腫瘤的發(fā)生發(fā)展和藥物敏感性。目前肺癌類器官已經(jīng)可以從多種不同病理類型的肺癌原始腫瘤成功培養(yǎng)，并具有一定的基因可操作性。越來越多的證據(jù)表明類器官可以用于精準(zhǔn)預(yù)測實(shí)體瘤患者體內(nèi)腫瘤的藥物敏感性，未來或可用于肺癌全程管理中的精準(zhǔn)治療方案選擇。本文將從歷史發(fā)展和基礎(chǔ)-臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用方面對肺癌類器官進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 腫瘤類器官概述

患者腫瘤組織培養(yǎng)的類器官(patient-derived organoid，PDO)是取材自患者的穿刺、手術(shù)標(biāo)本、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、胸水或肺泡灌洗液等經(jīng)過體外培養(yǎng)得到的有增殖和空間自組織能力的三維多細(xì)胞團(tuán)[1]。其形成有賴于標(biāo)本中有增殖分化能力的腫瘤細(xì)胞、組織中的干細(xì)胞和經(jīng)誘導(dǎo)分化的多能細(xì)胞。PDO培養(yǎng)成功率較高，約為50%～80%[2]，為利用患者腫瘤標(biāo)本建立大型生物標(biāo)本庫提供了機(jī)會。多類腫瘤目前已可構(gòu)建PDO，且成功培養(yǎng)的PDO在組織結(jié)構(gòu)[2]、基因組[3]、轉(zhuǎn)錄組以及功能上都與原始腫瘤組織高度相似，能夠很好地濃縮原始腫瘤的主要特征。目前，腫瘤類器官的培養(yǎng)是在含有細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的Matrigel三維(three dimension，3D)膠中添加含Wnt、R-spondin1、EGF和Noggin等[1-2]生長因子的培養(yǎng)基來完成，不同種類的腫瘤培養(yǎng)基成分略有不同，而最終形成的三維多細(xì)胞團(tuán)可以在96孔板或384孔板上進(jìn)行藥敏檢測。目前有越來越多的證據(jù)表明，PDO的藥敏結(jié)果可以用于臨床指導(dǎo)患者體內(nèi)腫瘤的精準(zhǔn)治療。

2 肺癌研究中的功能學(xué)模型

目前已有的腫瘤研究模型分為體內(nèi)(invivo)和體外(invitro)兩類。體外模型包括腫瘤細(xì)胞系(patient-derived cell line，PDCL)、腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)和類器官模型；體內(nèi)模型包括基因工程小鼠模型(genetically engineered mouse model，GEMM)、細(xì)胞系來源的異種移植瘤模型(cell-line derived xenograft，CDX)和患者腫瘤來源異種移植瘤模型(patient-derived xenograft，PDX)等。其中PDCL具有易于培養(yǎng)、增殖迅速、費(fèi)效比低等諸多優(yōu)點(diǎn)，故PDCL是目前應(yīng)用最為廣泛的腫瘤模型。但PDCL同時(shí)存在丟失原始腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性、對腫瘤的分子生物學(xué)和生理特點(diǎn)描述差等缺點(diǎn)。而腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)在這些方面略有優(yōu)勢，但培養(yǎng)條件復(fù)雜，培養(yǎng)周期長(約6個(gè)月)，在時(shí)效性上難以用于腫瘤患者的臨床選藥[4]。同時(shí)，無論是PDCL還是腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)都無法描述腫瘤微環(huán)境，而目前已知腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞及其分泌的生長因子會影響腫瘤細(xì)胞對靶向藥物的敏感性和耐藥性。相比之下，GEMM和PDX可以在小鼠體內(nèi)提供腫瘤微環(huán)境，但小鼠和人類腫瘤微環(huán)境的一致性仍需探究。而且，小鼠模型構(gòu)建成功率低、價(jià)格高、時(shí)間長，故亦難以實(shí)際應(yīng)用于高通量藥物篩選和臨床患者焦急的選藥場景[5]。因此就綜合培養(yǎng)成功率、時(shí)效性、費(fèi)用及對腫瘤藥敏描述的準(zhǔn)確性而論，混合細(xì)胞培養(yǎng)得到的類器官優(yōu)于其他模型[4]。相比于PDCL，PDO和PDX二者則具備可以模擬腫瘤組織學(xué)特征且腫瘤的基因組及表達(dá)組異質(zhì)性保存良好的特征，是目前實(shí)驗(yàn)室研究腫瘤生物學(xué)特性和藥物敏感性的重要模型，尤其是PDX可以用于驗(yàn)證在PDO中發(fā)現(xiàn)的腫瘤的藥敏特性。目前認(rèn)為，PDO可以保留絕大多數(shù)原始腫瘤的主克隆，同時(shí)，在結(jié)直腸癌和卵巢癌的研究中證實(shí)，類器官在大量擴(kuò)增之后發(fā)生遺傳突變的概率很小，傳代穩(wěn)定性較高[6]，但是能否高度還原原始腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性尚待研究。為更好地模擬腫瘤的生物學(xué)環(huán)境，PDO與血管生成間充質(zhì)干細(xì)胞及免疫細(xì)胞的共培養(yǎng)體系也在研究進(jìn)程中[7]。

因此，PDO具有匯集原始腫瘤特征、可操作性強(qiáng)、增殖較快、穩(wěn)定性較高、可高流量篩選、可建庫保存等優(yōu)點(diǎn)。盡管腫瘤類器官的臨床應(yīng)用仍需大規(guī)模臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)的探索，但結(jié)合以上優(yōu)點(diǎn)，PDO在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療癌癥的臨床前用藥決策中有著巨大的價(jià)值潛力。

3 肺癌類器官模型構(gòu)建的研究進(jìn)展

肺癌類器官的探索經(jīng)過了原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)、腫瘤細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)(2D-類器官)[4]、肺癌類器官3個(gè)階段的探索。培養(yǎng)標(biāo)本來源也從手術(shù)及穿刺標(biāo)本進(jìn)而發(fā)展到可以通過循環(huán)腫瘤細(xì)胞[8]、胸水或支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)。近年來，尸檢材料也已被用于成功建立PDX和PDO，這對于確定導(dǎo)致患者死亡的腫瘤最終狀態(tài)以及探究腫瘤的進(jìn)化和異質(zhì)性非常重要。尸檢材料的研究還可以對常規(guī)手段無法獲得的原發(fā)性和多發(fā)轉(zhuǎn)移性病灶進(jìn)行分子分析，并通過類器官研究其不同的藥物敏感性。同時(shí)，通過尸檢獲得大標(biāo)本可以協(xié)助研究腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)成分，這些成分可能是腫瘤進(jìn)展的重要驅(qū)動因素。

實(shí)體瘤類器官的培養(yǎng)相對于血液系統(tǒng)惡性腫瘤來說成功率較低。對于肺癌而言，穿刺標(biāo)本和血液標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量稀少、間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多，手術(shù)標(biāo)本同樣有間質(zhì)細(xì)胞混雜，且面臨組織消化過程對細(xì)胞的損傷，故實(shí)體瘤的類器官培養(yǎng)難度較大。

實(shí)現(xiàn)肺癌類器官培養(yǎng)經(jīng)歷了多種培養(yǎng)方式，包括促人多能干細(xì)胞分化[9]、調(diào)控原代細(xì)胞和肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化[10]以及通過“條件重編程”方法增加對腫瘤活檢物培養(yǎng)的成功性[11]等。有干性的細(xì)胞可以通過熒光激活細(xì)胞分選系統(tǒng)或磁珠抗體細(xì)胞分選系統(tǒng)進(jìn)行分離，并在2D培養(yǎng)基或含有Matrigel的3D培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)[5]。目前，氣管纖毛上皮類器官可以在數(shù)周內(nèi)從小鼠和人類氣管和上支氣管分離出的基底細(xì)胞成功培養(yǎng)構(gòu)建，同時(shí)可以對類器官的正常和組織修復(fù)狀態(tài)分別進(jìn)行分子生物學(xué)分析。由干細(xì)胞培養(yǎng)出含有2型呼吸上皮(alveolar type 2 cells/type 2 alveolar epithelial cell，AT2 / AEC2)肺泡樣類器官過程中需不含有基底細(xì)胞，而研究發(fā)現(xiàn)通過共培養(yǎng)表面活性蛋白C(surfactant protein C, SFTPC)陽性的AT2/AEC2干細(xì)胞和表達(dá)PDGF受體α的基質(zhì)成纖維細(xì)胞有利于培養(yǎng)出不含基底細(xì)胞的類器官。在類器官中尚未能重現(xiàn)在譜系標(biāo)記肺模型損傷后出現(xiàn)的1型呼吸上皮(alveolar type 1 cells/type 1 alveolar epithelial cell，AT1 / AEC1)祖細(xì)胞重建和AT2 / AEC2細(xì)胞擴(kuò)增現(xiàn)象，提示這一過程可能需要某些特殊的生長因子，或需要共培養(yǎng)AT1 / AEC1和AT2 / AEC2祖細(xì)胞來完成[5]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法則多用于形成同時(shí)具有上皮和間質(zhì)成分的肺類器官，以用于構(gòu)建肺的器官發(fā)育和疾病模型，并用于探究多種生長因子信號通路[5]。這些通過多能干細(xì)胞形成的類器官可用于在3D情況下研究上皮和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用以及研究微環(huán)境中的獨(dú)立細(xì)胞[12]。

構(gòu)建具有腺癌、鱗癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤特征的肺癌類器官可以通過在培養(yǎng)基中添加促分裂原，如配體激活劑神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)-酪氨酸激酶受體3(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 3，ERBB3)或酪氨酸激酶受體2(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 3，ERBB2)-ERBB3異二聚體來完成[13]。充分解決了肺癌分類多，治療方式不同的研究難題。

正常組織肺類器官可以用于構(gòu)建肺癌發(fā)生模型，即通過感染原癌基因過表達(dá)互補(bǔ)DNA(cDNA)或shRNA(short hairpin RNA)等基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)，在器官發(fā)育關(guān)鍵點(diǎn)誘發(fā)細(xì)胞異常增殖。利用該模型已先后證明了β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和Wnt信號通路在維持肺祖細(xì)胞增殖穩(wěn)定性中的關(guān)鍵作用[14]，以及SOX2(SRY-like HMG box 2)基因和Notch通路對KRAS(KRAS proto-oncogene)基因突變2型呼吸上皮細(xì)胞腺癌發(fā)生的影響[15]。通過該方法構(gòu)建的KRAS突變肺癌類器官可用于評估多種絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)抑制劑的療效，并與化療藥物和EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)對比，進(jìn)行中通量單藥及聯(lián)合用藥篩選[16]。肺類器官也已被用于研究與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的炎性反應(yīng)和組織損傷反應(yīng)，包括對肺纖維化[17]、博萊霉素誘導(dǎo)的組織損傷的反應(yīng)與上皮增殖狀態(tài)相關(guān)性[18]等。

4 肺癌類器官的臨床應(yīng)用

類器官作為功能學(xué)模型可以在以下場景中應(yīng)用于臨床：

第一，進(jìn)行腫瘤藥物敏感性檢測。腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)是最早以患者原始腫瘤直接構(gòu)建的藥物敏感性體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用于EGFR TKI和ALK TKI耐藥機(jī)制的探究[19]。相比于原代培養(yǎng)，肺癌PDO是腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的混合多細(xì)胞團(tuán)，可以一定程度綜合微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞對藥物敏感性的影響。目前有多項(xiàng)研究利用小鼠移植瘤模型驗(yàn)證了PDO與PDX的藥敏一致性，并有病例報(bào)道驗(yàn)證了PDO挑選的化療、靶向藥物在患者體內(nèi)對原始腫瘤有效[13, 20]。隨著免疫治療的不斷發(fā)展，成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞的類器官共培養(yǎng)成為了解癌癥及其腫瘤微環(huán)境之間免疫相互作用的新方法，并將用于肺癌免疫治療療效的研究。而肺類器官用于炎性反應(yīng)機(jī)制的研究已發(fā)現(xiàn)抗白介素-6(interleukin-6，IL-6)聯(lián)合順鉑作為IL-6+肺癌的潛在聯(lián)合用藥方案[21]。

第二，高通量藥物敏感性篩選。PDO的藥物敏感性篩選可以通過在96孔[22]和384孔[23]板中實(shí)時(shí)觀察其增殖和死亡情況[22]，同時(shí)對上百種藥物進(jìn)行藥物敏感性的篩查。故其在藥敏檢測上更為高效。

第三，臨床試驗(yàn)。肺癌類器官的臨床應(yīng)用尚待臨床試驗(yàn)證實(shí)其有效性，目前歐洲有兩項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)正在進(jìn)行，分別對晚期肺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療能否在類器官中驗(yàn)證療效(TUMOROID, NL49002.031.14)以及借助肺癌類器官進(jìn)行終線選藥的療效(SENSOR, NL50400.031.14)進(jìn)行研究。

5 肺癌類器官的局限性及展望

肺癌發(fā)病率高且其患者預(yù)期壽命有限，臨床上亟需可改善其預(yù)后的轉(zhuǎn)化研究，故針對肺癌的功能學(xué)臨床前模型的研究十分重要。盡管類器官模型研究正高歌猛進(jìn)，但其臨床應(yīng)用仍受到如下制約：1)類器官培養(yǎng)的開銷較高；2)類器官與原始腫瘤的一致性反映的是原始腫瘤的主克隆還是部分亞克隆仍待研究；3)類器官藥物敏感性指標(biāo)的解讀仍需研究，不同作用機(jī)制的藥物藥敏結(jié)果如何比較尚無定論；4)類器官培養(yǎng)成功率仍需提高，若希望將類器官技術(shù)應(yīng)用于一線選藥，其培養(yǎng)所需時(shí)間仍需縮短。類器官雖然在諸多方面體現(xiàn)出優(yōu)勢，但由于各個(gè)模型的適用場景各異，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室研究前，權(quán)衡利弊選擇合適的腫瘤功能學(xué)模型顯得尤為重要。

而類器官作為對原始腫瘤模擬性好、易于擴(kuò)增保存并能用于高通量藥敏篩選的臨床前模型成為目前肺癌轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中的研究熱點(diǎn)。肺癌類器官可以用于構(gòu)建腫瘤發(fā)生模型、研究病因?qū)W機(jī)制、轉(zhuǎn)移線索、藥敏篩選，并通過與其他細(xì)胞共培養(yǎng)研究腫瘤微環(huán)境，最終將會作為肺癌的個(gè)性化精準(zhǔn)治療的補(bǔ)充與現(xiàn)有的多組學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)決策體系相互補(bǔ)充。