湯思敏，朱 健，林曉敏，周 韜，周 燈，黃 超，王 平，焦文清，梁穎宜

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.稻米品質(zhì)安全控制湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

砷（As）分布廣泛且具有致癌性，被認(rèn)為是世界上最危險(xiǎn)的化學(xué)物質(zhì)之一[1]。水體As 污染主要來源于自然源與人為源，如長(zhǎng)期的地球化學(xué)變化與礦物礦石釋放；冶金、陶瓷、染料和農(nóng)業(yè)制藥廠等的工業(yè)廢水排放[2-4]。在天然水中發(fā)現(xiàn)的兩種主要As 形態(tài)為As（V）砷酸鹽與As（III）亞砷酸鹽，它們的存在取決于pH 和氧化還原條件[5]。由于現(xiàn)今As 污染日益嚴(yán)重并對(duì)人類健康和生態(tài)系統(tǒng)造成不利影響，As 污染已成為世界上最為關(guān)注的環(huán)境污染問題之一[6-8]。

由于As 污染的治理比較困難，迄今為止，有許多傳統(tǒng)技術(shù)被用于去除水中的砷，包括浮選，凝聚-沉淀，吸附，離子交換，膜過濾和電化學(xué)處理氧化還原、化學(xué)沉淀、過濾等，但因成本高、選擇性低、能耗高等缺點(diǎn)限制了它們的進(jìn)一步應(yīng)用[9-11]。生物吸附被普遍認(rèn)為是一種行之有效的水體As 污染去除方法[12]。自20 世紀(jì)90年代，生物質(zhì)被用于去除水體重金屬。生物吸附不僅受生物量的類型或化學(xué)組成的影響，而且受外界物理化學(xué)因素和溶液化學(xué)的影響[13]。近年來，微生物作為生物吸附劑的應(yīng)用比其他種類的生物吸附劑受到了更多的關(guān)注。已有研究報(bào)道了活菌和死菌與水體環(huán)境As 的去除作用，但無生命的生物質(zhì)往往是首選的，因?yàn)榇朔N生物吸附劑可以在極端pH 值下重復(fù)使用，用于連續(xù)處理有毒污染物，此外，由于不需要使用生長(zhǎng)介質(zhì)，死菌生物質(zhì)具有較好的成本效益和安全性[14]。

縱觀微生物修復(fù)水體重金屬污染的研究，國內(nèi)外關(guān)于細(xì)桿菌屬M(fèi)icrobacterium去除水體中重金屬的研究主要集中于Cr、Cu 等元素，而關(guān)于該菌屬去除水體As3+的研究鮮有報(bào)道[15-17]。本研究為了評(píng)價(jià)細(xì)桿菌屬去除水溶液中As3+的可行性，優(yōu)化了該菌的生長(zhǎng)條件與As3+吸附條件，并通過吸附動(dòng)力學(xué)與等溫吸附試驗(yàn)研究了該菌對(duì)As3+的吸附行為，通過SEM-EDX 與FTIR 分析分析了該菌對(duì)水體As3+的吸附機(jī)理，以期為As 污染的微生物修復(fù)提供必要的修復(fù)材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 耐As 細(xì)菌的分離

從湖南婁底冷水江礦區(qū)采集土樣，于4 ℃冰箱保存。稱取10.0 g 土樣放入100 mL 錐形瓶中并加入100 mL 無菌水，120 r/min 震蕩2 h，取出靜置15 min。用移液槍吸取200 μL 上清液，采用稀釋涂布法[11]接種在As3+濃度為100 mg/L 的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。挑選形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行分離劃線，純化后逐步遞增固體平板濃度，篩選出高耐As 菌株。

1.2 耐As 細(xì)菌的鑒定

通過16S rRNA 基因測(cè)序，引物為27F：5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R：5′- TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。由生工生物工程（上海）股份有限公司完成耐As 菌株的分子生物學(xué)鑒定。鑒定結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BlAST分析，用MEGA7.0 軟件系統(tǒng)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 耐As 菌株A4 的生長(zhǎng)條件優(yōu)化

1.3.1 菌株A4 的生長(zhǎng)曲線

配置200 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基于250 mL 錐形瓶中，將培育至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株以2%的接種量接入錐形瓶中，每隔2 h 用紫外可見分光光度計(jì)（島津 UV2600）測(cè)定其OD600值分別培養(yǎng)直至48 h，設(shè)置3 個(gè)平行樣，并以未加菌處理為對(duì)照（下同）。

1.3.2 不同因素對(duì)菌株A4 生長(zhǎng)的影響

將高耐砷菌株A4 接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h 后離心取濕菌體于80℃烘干至恒質(zhì)量，再研磨磨細(xì)成菌粉待用。

1.4 耐As 細(xì)菌的鑒定

配置200 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基于250 mL 錐形瓶中，將培育至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株以1%的接種量接入錐形瓶中，控制pH 值：5.0、6.0、7.0、 8.0、9.0；轉(zhuǎn)速：90、120、150、180、210 r/min； 溫度：20、25、30、35、40℃；無機(jī)鹽：0、0.25、0.50、0.75、1%，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24 h，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值。

1.5 菌株A4 菌粉對(duì)As3+吸附條件的正交優(yōu)化

采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化菌粉對(duì)As3+的最佳吸附條件。選擇菌粉投加量（g/L）、時(shí)間（h）、pH 值與溫度（℃）4 個(gè)指標(biāo)各作3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)L9（34），具體設(shè)計(jì)見表1。

通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（表1）開展菌粉對(duì)As3+的吸附試驗(yàn)。5 000 r/min，1 h 離心后取上清液，并用原子熒光光度計(jì)（吉天儀器 AFS-8220）測(cè)定濾液中As3+濃度。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，并以不加菌處理作為對(duì)照。

As3+的吸附量計(jì)算公式如下：

式中：q為菌粉對(duì)As3+的吸附量，mg/g；m為吸附質(zhì)質(zhì)量，g；C0為水中原有As3+濃度，mg/L；Ce為處理后水中剩余As3+濃度，mg/L。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of orthogonal test

1.6 最佳條件下菌株A4 對(duì)As3+的吸附動(dòng)力學(xué)

按正交試驗(yàn)得到的吸附最佳菌粉投加量、pH值、溫度于120 r/min 振蕩10、20、30、60、90、120、150、180 min 后離心過濾，收集上清液，待測(cè)。

1.7 最佳條件下菌株A4 對(duì)As3+的等溫吸附

按正交試驗(yàn)得到的最佳吸附時(shí)間、pH 值、溫度，加入菌粉以配制10 mg/ L、50 mg/ L、100 mg/ L、200 mg/ L、400 mg /L、500 mg/ L 濃度的溶液，于120 r/min 振蕩后離心過濾，收集上清液，待測(cè)。

1.8 菌株A4 對(duì)As3+的吸附機(jī)理

收集吸附溶液As 后的菌粉，于80 ℃烘干24 h，用研磨磨細(xì)樣品后，進(jìn)行SEM-EDX分析與FTIR分析。

1.9 數(shù)據(jù)計(jì)算與分析

吸附動(dòng)力學(xué)研究通過準(zhǔn)一階動(dòng)力學(xué)與準(zhǔn)二階動(dòng)力學(xué)進(jìn)行擬合；吸附等溫研究通過Langmuir 與Freundlich 模型進(jìn)行擬合。

式中：K1和K2為吸附速率常數(shù)，Qe與Qt為平衡溶液As3+濃度與時(shí)間t時(shí)溶液As3+濃度（mg/g）。

式中：Qe與Qm分別為菌粉對(duì)As3+吸附量與最大吸附量，mg/kg；Ce為吸附平衡溶液中As3+濃度，mg/L；KL、KF與n均為吸附常數(shù)。

使用Excel 2016 處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，Origin 9.0 繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐砷菌株的鑒定

從土樣中篩出23 種菌株，其固體平板的最小抑菌濃度為40 mmol/L。進(jìn)一步提高固體平板的As3+濃度至53 mmol/L，最終只有4 株菌株能繼續(xù)生長(zhǎng)。選取其中一株菌命名為A4，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行鑒定，將所得序列在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行序列同源性比較，用MAGE X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。耐As 菌株與多株Microbacterium的序列相似性達(dá)到99%，可確定耐As 菌株為細(xì)桿菌屬M(fèi)icrobacterium。通 過16S rRNA 基 因 測(cè) 序， 引 物 為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

圖1 耐As 菌株的16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.1 Phylogenetic tree of arsenic resistant strain

2.2 菌株A4 生長(zhǎng)曲線

菌株A4 的生長(zhǎng)曲線見圖2。由圖可知，0 ～ 10 h 為菌株A4 生長(zhǎng)的遲緩期，10 ～30 h 為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，30 ～44 h 為穩(wěn)定期，44 h 后進(jìn)入衰亡期。

2.3 菌株A4 生長(zhǎng)條件優(yōu)化

圖2 菌株A4 生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of bacterial strain A4

溫度、pH 值、NaCl 濃度、轉(zhuǎn)速對(duì)菌株A4 生長(zhǎng)的影響見圖3?？梢钥闯?，當(dāng)無機(jī)鹽濃度低于0.25%時(shí)，菌株A4 生長(zhǎng)良好，而當(dāng)無機(jī)鹽高于0.25%時(shí)菌株生長(zhǎng)量急劇下降，菌株A4 生長(zhǎng)最適無機(jī)鹽濃度為0.25%。當(dāng)轉(zhuǎn)速低于180 r/min 時(shí)，菌株A4 生長(zhǎng)隨轉(zhuǎn)速增加呈逐漸升高的趨勢(shì)，高于180 r/min 時(shí)生長(zhǎng)量反而下降，菌株A4 生長(zhǎng)最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。菌株A4 在pH 值為7.0 ～9.0的范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，pH 值高于7，菌株生長(zhǎng)量明顯提升，說明菌株A4 更適合在中性以及弱堿性的環(huán)境下生長(zhǎng)。此外，菌株A4 生長(zhǎng)最適溫度為30℃，但在溫度為20 ～40℃時(shí)皆能生長(zhǎng)。

2.4 菌株A4 對(duì)As3+吸附條件的正交優(yōu)化

圖3 不同條件下菌株A4 的OD600 值Fig.3 OD600 value of bacterial strain A4 under different conditions

正交試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），各因素不同水平下的變化趨勢(shì)范圍為IIA＞IA＞IIIA、IIB＞IB＞IIIB、IIIC＞IIC＞IC和ID＞IID＞IIID，表明在各因素所選定范圍中，菌株A4 所制菌粉吸附溶液中As3+的最佳條件為A2B2C3D1，即菌粉投加量為0.02 g/L、吸附時(shí)間為2 h、pH 值為8.0 和溫度為20 ℃，此條件下菌粉對(duì)As3+的吸附量為128 mg/g。各因素的極差范圍在25 ～147，其中溫度最大，說明其對(duì)菌粉吸附As3+的影響最大。

2.5 菌株A4 對(duì)As3+的吸附動(dòng)力學(xué)研究

菌株A4 對(duì)As3+的吸附動(dòng)力學(xué)特征如圖4 所示。隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株A4 從10 min 到120 min 對(duì)的吸附量顯著增加，120 min 達(dá)到吸附平衡。由表3 可知，準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)相關(guān)系數(shù)R2（0.989）大于準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)相關(guān)系數(shù)R2（0.953），說明菌株A4 對(duì)As3+的吸附過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，所以菌株A4 最大吸附量為132.5 mg/g。

2.6 菌株A4 對(duì)As3+的等溫吸附研究

圖2 所示為菌株A4 對(duì)As3+吸附的L 型（圖5 a）和F 型（圖5 b）吸附等溫線。隨著外源添加As3+濃度的增加，菌株A4 對(duì)As3+的吸附量呈逐漸上升的趨勢(shì)。由Langmuir 方程擬合可知，菌株A4 對(duì)As3+的最大吸附量達(dá)114.6 mg/g，吸附常數(shù)KL值為0.016。KL可以表示吸附劑的吸附能力，在0 ～1 之間有利于吸附，KL在0 ～1 之間說明A4 對(duì)As3+的吸附容易進(jìn)行。由Freundlich 方程擬合可知，吸附常數(shù)KF與n分別為5.65 和0.52。一般認(rèn)為，n的數(shù)值在0 ～0.5 之間易于吸附，n為0.52說明吸附過程易進(jìn)行。由圖可知，Langmuir 方程所得R2（0.99）優(yōu)于Freundlich 方程所得R2（0.94），所以A4 對(duì)As3+的吸附更符合Langmuir 等溫吸附方程，其吸附以單分子層吸附為主。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The results of the orthogonal test

圖4 菌株A4 對(duì)As3+吸附的動(dòng)力學(xué)特征Fig.4 Adsorption kinetics of As3+ onto strain A4 described by pseudo-first order model and pseudo-second order model by curves

表3 菌株A4對(duì)As3+吸附的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 3 Kinetic parameters for the sorption of As3+ by stain A4

2.7 菌株A4 對(duì)As3+的吸附機(jī)理分析

為明確菌株A4 制成菌粉對(duì)溶液As3+的吸附機(jī)理，利用SEM-EDX 掃描測(cè)定了吸附與不吸附As3+時(shí)菌粉的表面形態(tài)。從圖6(a)和6(c)可以發(fā)現(xiàn)，未吸附As3+的菌粉表面光滑，呈桿狀，菌株A4 菌粉吸附As3+后，表明形態(tài)和大小發(fā)生了顯著變化，具體表現(xiàn)為表面褶皺增多，團(tuán)粒變大，這也體現(xiàn)了菌株A4 菌粉對(duì)溶液中As3+的吸附效應(yīng)。

此外，通過能譜分析得到了菌株A4 菌粉在無As3+（圖6b）和含As3+（圖6d）處理下的離子裝載情況。結(jié)果表明，在無As 處理中，菌粉表面存在C、O、K、P、Pt、Mg、Nb 峰，而在含As 處理中的菌粉存在C、O、As 峰，說明As3+替換了菌粉表面原有的K、Pt、Mg、Nb 離子，并可能與P 元素大量螯合。上述結(jié)果也與紅外光譜分析結(jié)果一致。

圖5 菌株A4 對(duì)As3+吸附的等溫吸附特征Fig.5 Adsorption isotherm fitted by Langmuir model (a) and Freundlich model (b) by curves of As3+ onto strain A4

圖6 菌株A4 菌粉吸附As3+前后的掃描電鏡與能譜圖Fig.6 SEM-EDX images of the bacteria powder of the strain A4: (a), (c) without sorption of As3+, (b), (d)sorption of As3+

圖7 為負(fù)載As3+和未負(fù)載As3+的菌株A4菌粉的紅外光譜分析，用以確定可能導(dǎo)致As3+吸附的官能團(tuán)。如圖4 所示，對(duì)比未吸附As3+處理，菌粉吸附As3+后，表面-OH、-CHO、-COOH、-NH與O-P-O等功能團(tuán)變化顯著，其中-OH的最大峰峰型變窄，峰值由3 404 cm-1轉(zhuǎn)移至3 385.39 cm-1，這體現(xiàn)了As3+與-OH 的絡(luò)合作用，而-CHO（2 927.21 cm-1） 與-COOH（1 654.93 cm-1）功能團(tuán)峰強(qiáng)則均有所增加；峰值1 542.04 cm-1和1 452.92 cm-1處為細(xì)胞蛋白質(zhì)酰胺帶，受-CN伸展振動(dòng)與-NH 彎曲振動(dòng)影響顯著，菌粉吸附As3+后，峰強(qiáng)分別轉(zhuǎn)移至1 654.93 cm-1和1 453.11 cm-1；另一個(gè)變化是從1 404.75 cm-1到1 400.41 cm-1，此對(duì)應(yīng)了As3+與-NH 基團(tuán)的螯合效應(yīng)；在峰值1 238.34 cm-1處，菌粉吸附As3+后峰值轉(zhuǎn)移至1 237.47 cm-1，這可能與As3+與細(xì)胞壁中多糖組分中的C-O-C 的結(jié)合有關(guān)；此外，另一個(gè)弱吸收峰強(qiáng)從533.00 cm-1轉(zhuǎn)移至533.68 cm-1，對(duì)應(yīng)多糖的O-P-O 的剪接振動(dòng)。因此，以上的光譜變化可能是As3+與菌株A4 菌粉上的-OH、-COOH、-NH與酰胺等基團(tuán)相互作用的結(jié)果。

3 討 論

近年來，利用微生物方法處理污染水體中的As 已日趨增多，但菌種類型不同，生長(zhǎng)特性存有差異，必然會(huì)影響其對(duì)As 的去除效率。Podder 等[18]發(fā)現(xiàn)耐As 菌株MTCC 4380Bacillus arsenicus的最佳生長(zhǎng)pH 為7.0，且對(duì)As3+的耐受閾值為1 000 mg/L；Battaglia-Brunet 等[19]經(jīng)分離得到的耐As菌株DSM 16361 or B6TThiomonas arsenivorans，其生長(zhǎng)pH 值范圍在4.0 ～7.5，其耐As 能力為100 mg/L。本研究從As 污染礦區(qū)土壤分離出一株高耐As 菌株A4Microbacterium，其對(duì)As3+的耐受閾值為53 mmol/L，并在pH 值范圍5.0 ～7.0時(shí)的OD600值顯著上升，且在7.0 ～9.0 時(shí)平穩(wěn)增長(zhǎng)，體現(xiàn)出A4 菌株對(duì)水體環(huán)境pH 值的高度適應(yīng)能力，有利于實(shí)際治理工業(yè)廢水的應(yīng)用。

圖7 菌株A4 菌粉吸附As3+前后的紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of the bacteria powder of the strain A4 before and after sorption of As3+

眾多研究報(bào)道了細(xì)菌、真菌及微藻類等對(duì)As3+的不同吸附能力。Sari 等[20]利用Langmuir 模型擬合得到無生命的綠藻Maugeotia genuflexa的最大As3+吸附量為57.48 mg/g；Wu 等[20]通過對(duì)酵母菌對(duì)As3+的吸附試驗(yàn)得到最大As3+吸附量為62.91 μg/g。而Asadi Haris 等[11]從位于北極極寒地區(qū)某池塘沉積物中收集到菌種Yersinia sp.，進(jìn)行了Langmuir 與Freunlich 吸附等溫線擬合，并得到該菌株對(duì)As3+的最大吸附量為159 mg/g。本研究通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到菌株A4 所制菌粉在最佳吸附條件下對(duì)As3+的吸附量可達(dá)128 mg/g，并通過吸附動(dòng)力學(xué)證實(shí)了菌粉在120 min 左右時(shí)間可達(dá)吸附飽和狀態(tài)，通過Langmuir 方程擬合得到菌株A4 所制菌粉對(duì)As3+的最大吸附量為114.6 mg/g，該值雖低于極耐寒菌對(duì)As3+的吸附量，但遠(yuǎn)優(yōu)于常規(guī)生長(zhǎng)條件下其它菌種對(duì)As3+的吸附能力，因此菌株A4 對(duì)As 污染水體As3+的去除潛力是值得肯定的。

為探明菌株A4 所制菌粉對(duì)水溶液中As3+的吸附機(jī)理，本研究進(jìn)行了含As3+與不含As3+水溶液下所得菌粉的SEM-EDX 分析與FTIR 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比未含As3+溶液所得菌粉，含As3+溶液所得菌粉表面皺褶明顯增多，且團(tuán)粒結(jié)構(gòu)變大，這體現(xiàn)了As3+在菌粉表面的吸附作用。死菌細(xì)胞表面往往呈現(xiàn)負(fù)電荷并有較多的吸附位點(diǎn)，促進(jìn)了其對(duì)As3+的吸附能力。此外，由能譜圖可知（圖6c, d）可知，菌粉表面發(fā)生了Mg2+與As3+的離子交換作用，此過程亦促進(jìn)了菌粉對(duì)As3+的吸附。大量研究表明，死細(xì)菌的細(xì)胞壁與代謝產(chǎn)物會(huì)暴露大量活性基團(tuán)如羧基、羥基、氨基等，這是菌粉吸附As3+的重要機(jī)制[21-22]。本研究表明：菌株A4 細(xì)胞壁上的的-OH、-COOH、-NH 與酰胺等基團(tuán)與As3+發(fā)生了絡(luò)合作用，實(shí)現(xiàn)了菌粉對(duì)As3+的吸附效應(yīng)。

綜上所述，菌株A4 對(duì)水體As3+的吸附能力為水體環(huán)境容量提供了正效應(yīng)，對(duì)后續(xù)As 污染水體的微生物治理具有理論與指導(dǎo)意義。未來可繼續(xù)探究在不同改性條件下該菌粉對(duì)As3+吸附效果有何變化或該菌粉對(duì)不同重金屬的吸附特征與機(jī)理，以完善水體重金屬污染微生物治理方法體系。

4 結(jié) 論

1）通過單因素試驗(yàn)對(duì)菌株A4 進(jìn)行生長(zhǎng)條件優(yōu)化，得到最適生長(zhǎng)條件為溫度30℃、pH值7.0～9.0，轉(zhuǎn)速180 r/min，NaCl 濃度0.25m/v。

2）分離菌株A4 所制菌粉對(duì)As3+吸附的正交優(yōu)化條件為：菌粉投加量0.02 g/L、吸附時(shí)間2 h、pH 值8.0 和溫度20℃，此條件下菌粉對(duì)As3+的吸附量為128 mg/g。

3）吸附動(dòng)力學(xué)擬合數(shù)據(jù)顯示菌粉對(duì)As3+的吸附符合準(zhǔn)一階動(dòng)力學(xué)；Langmuir 模型較Freundlich模型更適合描述菌株A4 所制菌粉對(duì)As3+的吸附特征，且最大As3+量為114.6 mg/g。

4）菌株A4 所制菌粉對(duì)As3+的吸附機(jī)理一方面在于菌粉表面Mg2+和As3+的離子交換作用，另一方面在于菌粉表面的羧基、羥基、胺基等活性基團(tuán)與As3+的絡(luò)合作用。向As 污染水體施加菌株A4 有利于去除As3+，從而提升水體環(huán)境容量。