彭俊懿，林 巧，石江濤

（南京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

在木材解剖的研究中，不同細(xì)胞或組織水平上，高質(zhì)量的顯微切片是必要的基礎(chǔ)工作。現(xiàn)階段的顯微切片制作中，無論是用于觀察的石蠟切片[1]、滑走切片[2]，還是半薄切片，染色都是關(guān)鍵步驟。幾十年來，對(duì)于木材顯微切片染色方法的研究已有較多報(bào)道。隨著染色劑的多樣化，多個(gè)染色劑對(duì)顯微切片進(jìn)行復(fù)染的染色方法也越來越受關(guān)注。番紅-固綠雙染法是植物制片中最普通的二重染色法，染色手續(xù)簡(jiǎn)單并能清晰的顯示出細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[3]。國內(nèi)早在1960年江西師范學(xué)院的生物制片手冊(cè)就已記錄了番紅-固綠雙重染色法；1979年容壽柏嘗試在其基礎(chǔ)上嘗試兩色一步整染改進(jìn)[4]；而后很多學(xué)者對(duì)番紅-固綠雙染進(jìn)行了減少耗時(shí)和提高染色效果的改進(jìn)[5-6]。至今番紅-固綠經(jīng)典雙染法已廣泛運(yùn)用于各類研究中。番紅-固綠雙染法多用于細(xì)胞化學(xué)成分區(qū)別較大的細(xì)胞切片，如制作樹皮、樹葉等植物組織的顯微切片使用番紅-固綠雙染法鏡檢出石質(zhì)化和栓質(zhì)化的細(xì)胞呈紅色[7-8]，制作應(yīng)拉木鵝掌楸顯微切片時(shí)使用番紅-固綠雙染法鏡檢出呈綠色的區(qū)域中膠質(zhì)木纖維含量高[9]。而細(xì)胞化學(xué)成分差異較小的細(xì)胞切片，番紅-固綠經(jīng)典雙染法會(huì)出現(xiàn)不適用的情況。

阿利新藍(lán)[10]為羧基基團(tuán)染色劑。在木材木質(zhì)部中，羧基大多位于纖維素和半纖維素中，一般認(rèn)為木質(zhì)素中不存在羧基[11]。推測(cè)新藍(lán)的染色目標(biāo)應(yīng)該與固綠是一致的。新藍(lán)的染色研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開展較多[12]，在木材研究和植物研究領(lǐng)域僅有很少的報(bào)道[13]。新藍(lán)與其他染料復(fù)染的相關(guān)研究國內(nèi)幾乎沒有開展。為拓展木材顯微切片的雙染染色方法，以及進(jìn)一步提高顯微切片的清晰度和分辨率，從細(xì)胞染色角度入手建立一種更有效的顯微制片方法。其中番紅O 幾乎可以與任何染料配合在一起，用作雙重、三重或四重染色[3]。選取樟子松木質(zhì)部為實(shí)驗(yàn)材料，采用了番紅、固綠和阿利新藍(lán)三種染料，對(duì)樟子松木材切片進(jìn)行了單染和復(fù)染。就番紅-新藍(lán)雙染法進(jìn)行了改良，通過鏡檢和拍照比較染色效果，找到了效果滿意的染色工藝流程，希望能得到廣泛的實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樟子松木材采自黑龍江省雞東縣大頂山。樹齡約22 a，在胸高處取10 cm 厚圓盤，帶回實(shí)驗(yàn)室氣干備用。番紅O（Safranine O）（上海金穗公司）分子式為C20H19ClN4，相對(duì)分子質(zhì)量：350.85；固綠（Fast green FCF）（MACKLIN 公司）分子式為C37H34N2O10S3Na2，相對(duì)分子質(zhì)量：808.85；阿拉丁的阿利新藍(lán)（Alcian blue 8GX）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）分子式為C56H68N16S4Cl14Cu，相對(duì)分子質(zhì)量：1 295.86，以下簡(jiǎn)稱新藍(lán)。

1.2 顯微切片制作

取樟子松中心條，以髓心開始的3 ～9年輪之間的木質(zhì)部作為染色試樣。使用純凈水進(jìn)行90 ℃水浴軟化2 h，使用日本電動(dòng)式組織切片機(jī)REM-710 進(jìn)行厚度15 ～20 um 組織切片，分別切取橫切面、徑切面和弦切面；應(yīng)力釋放6 h 后備用。染色劑為1%番紅水溶液；0.5%固綠的95%乙醇溶液，1%新藍(lán)的70%乙醇溶液。染色脫水后封片；染色流程對(duì)不同的樹種和不同的部位存在一定差異[14]，本研究所用染色流程見表1。常用封片方式有臨時(shí)封片和永久性封片，臨時(shí)封片是在脫水處理以后不進(jìn)行透明處理而直接用甘油進(jìn)行封片，臨時(shí)封片操作少、出片速度快，本文選用臨時(shí)封片。新藍(lán)和固綠單染時(shí)脫水至染色劑對(duì)應(yīng)的酒精濃度后染色即可，其他流程與番紅單染流程基本一致。使用日本OLYMPUS BX51 光學(xué)顯微鏡觀察切片并拍照，而后使用Oplenic 軟件進(jìn)行測(cè)量和記錄。

改進(jìn)后的番紅-新藍(lán)雙染具體流程如下：1%番紅染色60 min；30%～70%乙醇梯度脫水，各 2 min； 酸 洗1 min；1% 新 藍(lán) 染 色2 min；70%乙醇洗凈浮色后使用甘油封片。其中酸洗液為13%～17%冰乙酸的70%乙醇溶液。

1.3 管胞解離

選取第3 ～9年輪，將樣品以早晚材分開，切成細(xì)條后使用富蘭克林離析法解離樟子松管胞。將樣品置于試管內(nèi)，加入去離子水后放入70℃水浴鍋至樣品全沉水；而后換入由30%過氧化氫溶液與冰乙酸1∶1 混合制得的解離液中，放入沸水浴中蒸煮至試樣膨化和完全變白；將樣品取出，用去離子水進(jìn)行沖洗5 ～6 次，分別滴入番紅、固綠和新藍(lán)進(jìn)行染色；觀察時(shí)只需將其滴在載玻片上并蓋上蓋玻片即可，使用日本OLYMPUS BX51 光學(xué)顯微鏡觀察。

表1 脫水和染色流程Table 1 Dehydration and dyeing treatment

2 結(jié)果與分析

2.1 單染

對(duì)樟子松橫切面顯微切片進(jìn)行番紅、固綠和新藍(lán)單染效果如圖1 所示。圖1-a 是使用番紅染色，其中早晚材管胞均被染成紅色，射線位置也被染上紅色；圖1-b 圖是使用固綠染色，早晚材管胞被染成藍(lán)綠色，射線上染顏色較淡，能觀察到有沉積的色塊；圖1-c 圖是使用新藍(lán)染色，對(duì)軸向管胞上染程度極低，射線位置能觀察到染上了明顯藍(lán)色。有學(xué)者研究認(rèn)為新藍(lán)對(duì)針葉材的管胞幾乎不染色，對(duì)泌脂細(xì)胞和薄壁細(xì)胞染色效果較好[13]，據(jù)此推測(cè)：圖1-c 圖中射線位置被新藍(lán)染成明顯藍(lán)色的細(xì)胞是射線薄壁細(xì)胞。僅以細(xì)胞壁的染色情況排序：番紅染色效果優(yōu)于固綠，新藍(lán)染色效果最差。

圖1 三種染料單染效果Fig.1 Staining effect of three dyes

2.2 復(fù)染

為比較對(duì)木材顯微切片的番紅-固綠復(fù)染和番紅-新藍(lán)復(fù)染效果。對(duì)樟子松三切面進(jìn)行番紅-固綠雙染后效果見圖2 中a、b 和c，三圖中僅呈現(xiàn)紅色，未見細(xì)胞被染為明顯綠色。圖2-a 中在輪界線上能夠觀察到極其輕微的綠色；在圖2-b 圖中能看到很多固綠沉積的綠色色塊；圖2-c 中觀察不到有綠色。番紅-新藍(lán)雙染效果見圖2 中d、e 和f。與番紅-固綠雙染不同，番紅-新藍(lán)雙染后能觀察到部分細(xì)胞被染成藍(lán)綠色。圖2-d 中橫切面上射線薄壁細(xì)胞被染為藍(lán)綠色，樹脂道內(nèi)也能觀察到被染成藍(lán)綠色的薄壁細(xì)胞和內(nèi)含物；圖2-e 中單列木射線內(nèi)的射線薄壁細(xì)胞被染為藍(lán)綠色，紡錘形木射線中多見綠色的薄壁細(xì)胞包裹絮狀團(tuán)的結(jié)構(gòu)；圖2-f 中也能觀察到射線薄壁細(xì)胞染成了綠色，但是綠色分布不均，染色程度較低。

樟子松管胞和薄壁細(xì)胞的化學(xué)成分存在差異。管胞木質(zhì)化程度高于薄壁細(xì)胞，管胞細(xì)胞壁含大量木質(zhì)素和結(jié)晶度較高的纖維素，薄壁細(xì)胞細(xì)胞壁內(nèi)纖維素和半纖維素含量高于木質(zhì)素。固綠在水溶液中溶解度為4%，在酒精內(nèi)溶解度能達(dá)到9%[14]。在其他學(xué)者的研究中番紅-固綠雙染時(shí)，固綠上色較快，15 s 就能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色[15-17]。本次實(shí)驗(yàn)中使用的是1%固綠溶液（95%乙醇溶劑）染色時(shí)間2 min，依然沒有染上綠色。因此番紅-固綠雙染不適用于樟子松木質(zhì)部顯微切片，固綠都沉積成了色塊，沒有對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。新藍(lán)多用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)?dòng)物細(xì)胞染色，屬于陽離子染料，能與組織內(nèi)含有的陰離子基團(tuán)，如羧基和硫酸根等形成不溶性復(fù)合物[18-19]。本次番紅-新藍(lán)雙染實(shí)驗(yàn)中，樟子松管胞被染成紅色，薄壁細(xì)胞（射線薄壁細(xì)胞和泌脂細(xì)胞均為薄壁細(xì)胞）被染成藍(lán)綠色。說明了番紅-新藍(lán)雙染適用于樟子松木質(zhì)部顯微切片的染色。

圖2 復(fù)染與改進(jìn)后效果Fig.2 The staining and improved results

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道稱，新藍(lán)在酸性環(huán)境下對(duì)羧基著色效果更為活躍[18-19]。對(duì)番紅-新藍(lán)雙染工藝進(jìn)行改進(jìn)，在新藍(lán)著色過程中為其提供一個(gè)酸性反應(yīng)環(huán)境。染色改進(jìn)后，木材細(xì)胞染色清晰、染色程度較高、易于辨識(shí)，見圖2 g ～ l。能夠看到經(jīng)過改進(jìn)后的番紅-新藍(lán)雙染法區(qū)分細(xì)胞組織的能力非常優(yōu)秀，把樟子松軸向管胞染成紅色，把樟子松射線薄壁細(xì)胞和樹脂道泌脂細(xì)胞染成藍(lán)色，紅色和藍(lán)色兩個(gè)顏色之間沒有出現(xiàn)相互混合的現(xiàn)象。特別是在圖2-l 中，番紅-新藍(lán)雙染對(duì)薄壁細(xì)胞的染色效果明顯比圖2-f 未改進(jìn)前的染色效果要好，能看到不僅厚壁管胞被均勻的染成紅色，射線薄壁細(xì)胞也被均勻的染成亮藍(lán)色，從染色效果上能看出酸性反應(yīng)環(huán)境提高了新藍(lán)對(duì)薄壁細(xì)胞的染色活力。能夠清楚的觀察到射線薄壁細(xì)胞和射線管胞的形態(tài)。清楚地觀察到射線管胞內(nèi)壁有鋸齒狀加厚，鋸齒狀加厚存在于硬松類，如馬尾松、油松和黑松等。而在紅松、華山松和白皮松等軟松類中射線管胞內(nèi)壁平滑。鋸齒狀加厚對(duì)木材識(shí)別與鑒定具有重要意義[11]。

酸洗過程會(huì)破壞番紅的著色，冰乙酸含量過高會(huì)導(dǎo)致切片上番紅嚴(yán)重褪色；酸洗不足則難以提高新藍(lán)活性，導(dǎo)致切片染色不均勻或不上色。研究以后酸洗液配比為13%～17%冰乙酸的70%乙醇溶液是效果較好的。研究動(dòng)物骨骼和粘液細(xì)胞染色的學(xué)者們發(fā)現(xiàn)：亮藍(lán)色是新藍(lán)染色效果較好和染色活力較高的宏觀表現(xiàn)[19-20]。

2.3 解離后管胞和樹脂道的染色

在針葉材管胞形態(tài)的研究中，管胞解離是比較常用的方法。在管胞解離以后需要對(duì)管胞進(jìn)行染色處理，高質(zhì)量的染色能有效地幫助觀察者判別管胞是否完整。前文已得知三種染料對(duì)管胞單染的效果是：番紅染色效果優(yōu)于固綠，新藍(lán)染色效果最差。但是分別將番紅、固綠和新藍(lán)用于已解離的管胞染色后，出現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象：新藍(lán)對(duì)管胞的染色效果最好、程度最高，如圖3 所示。圖3-a 顯示管胞被番紅染成紅色，圖3-b 反映固綠染色效果較差，圖3-c 中管胞被新藍(lán)染成了藍(lán)色。新藍(lán)對(duì)管胞上色效果較好的原因可能是解離體系中含有冰醋酸滲入管胞腔，在沖洗時(shí)沒有完全去除，而冰醋酸的存在恰恰改變了染色體系的pH 值，提高了新藍(lán)對(duì)管胞的上染。靜置1 天后使用pH 試紙測(cè)得，管胞內(nèi)殘留的乙酸使得溶液變成了酸性。新藍(lán)管胞溶液依舊無色透明，能用肉眼觀察到新藍(lán)全染到了懸浮的管胞上。證明冰乙酸中的-COOH 沒有參與反應(yīng)，新藍(lán)是對(duì)管胞上的-COOH 染色。番紅染色效果比新藍(lán)略差，固綠染色程度遠(yuǎn)低于前二者。

圖3 解離后管胞的染色，F(xiàn)ig.3 The processed tracheid

分別將番紅、固綠和新藍(lán)用于樟子松含樹脂道的顯微切片染色，得到的效果如圖4 所示。能觀察到圖4-a 和圖4-b 中番紅和固綠分別把切片內(nèi)所有細(xì)胞和內(nèi)含物都染上了顏色。番紅、固綠和新藍(lán)都能對(duì)樹脂道的內(nèi)含物染色，再加上新藍(lán)對(duì)軸向管胞上染程度極低的反差，在以樹脂道為研究對(duì)象的顯微切片制作中新藍(lán)單染是最好的選擇。

3 結(jié)論與討論

對(duì)樟子松橫切面顯微切片進(jìn)行番紅、固綠和新藍(lán)單染后鏡檢得，番紅對(duì)木質(zhì)化程度高的厚壁管胞染色效果最好；新藍(lán)對(duì)木質(zhì)化程度低的薄壁細(xì)胞染色效果最好；固綠染色效果居于兩者之間。對(duì)比樟子松橫切面顯微切片復(fù)染效果得，該流程操作下番紅-固綠雙染不適用于樟子松木質(zhì)部顯微切片的制作，固綠都沉積成了色塊，沒有對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。番紅-新藍(lán)雙染能區(qū)分樟子松細(xì)胞組織，樟子松管胞被染成紅色，薄壁細(xì)胞（射線薄壁細(xì)胞和泌脂細(xì)胞均為薄壁細(xì)胞）被染成藍(lán)綠色。薄壁細(xì)胞的染色不夠理想，改進(jìn)后的番紅-新藍(lán)雙染效果較好，能清楚地區(qū)分木材細(xì)胞組織，薄壁細(xì)胞染色更加充分、均勻。

圖4 樹脂道的染色Fig.4 Staining of resin canal

已有較多對(duì)木材組織染色的同類研究，如能染細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)的蘇丹黑[21]；能染高度木質(zhì)化、栓質(zhì)化細(xì)胞的番紅[22]和甲苯胺藍(lán)[23]；能染糖類的高碘酸-Schif[24]等。該方法優(yōu)點(diǎn)在于能夠簡(jiǎn)單快速的區(qū)別木材中薄壁細(xì)胞和厚壁細(xì)胞。傳統(tǒng)的番紅-固綠雙染能夠通過調(diào)控時(shí)間來達(dá)到對(duì)不同石質(zhì)化細(xì)胞的區(qū)分，調(diào)控時(shí)間來達(dá)到區(qū)分不同木材的薄壁細(xì)胞將是該方法進(jìn)一步的研究方向。往后計(jì)劃將對(duì)多種木材進(jìn)行試驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的可靠性和普試性，解決本次試驗(yàn)樣本單一的問題。在對(duì)一些特殊木材的試驗(yàn)中，如應(yīng)力木，應(yīng)該結(jié)合現(xiàn)代儀器分析技術(shù)，完善該方法，達(dá)到定性、半定量甚至定量的目的。對(duì)解離后的管胞染色觀察發(fā)現(xiàn)，新藍(lán)單染效果略高于番紅，二者都能夠得到很好的觀察效果，但從經(jīng)濟(jì)方面考慮，番紅依舊是解離后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色的首選。在以樹脂道為研究對(duì)象的顯微切片制作中新藍(lán)單染是最佳選擇。綜上所述，木材細(xì)胞對(duì)不同染料響應(yīng)各異，同時(shí)也受到染色介質(zhì)的影響。