劉晶 劉偉

為鳶尾科植物射干Belamcandachinensis（L.）DC. 的干燥根莖。射干味苦、性寒，是經(jīng)常使用的中藥之一。其中鳶尾苷、野鳶尾苷等異黃酮是射干中的主要活性成分。射干中的異黃酮類化合物具有抗炎、抗腫瘤、殺菌消毒、清除自由基等作用，因而建立最優(yōu)的提取方法最大限度的將射干中的異黃酮類化合物提取出來(lái)是具有重要意義的。可以應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)射干中的兩種異黃酮進(jìn)行研究并測(cè)定其含量，因此本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法從更換實(shí)驗(yàn)變量方面對(duì)射干中有效成分異黃酮的提取進(jìn)行探索，從而得到最佳的提取條件。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1、儀器

高效液相色譜儀（Agilent1100， Agilent Technologies， Germany），G1315B二極管陣列檢測(cè)器，G1311A四元泵，G1312A在線真空脫氣機(jī)，Rheodyne7225i定量進(jìn)樣閥，安捷倫色譜工作站。

RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;WK-1000A高速藥物粉碎機(jī)（青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司）;SK3300LH超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

2、 試劑與藥材

樣品提取所用的試劑（甲醇、乙醇、乙酸乙酯）為分析純?cè)噭熍_(tái)市雙雙化工有限公司）;分析型液相檢測(cè)所用甲醇試劑為色譜純（Tedia company， INC， USA），所用的水是娃哈哈純凈水;實(shí)驗(yàn)用水是自蒸的一次水。射干藥材購(gòu)于聊城利民大藥店。

3、色譜條件

色譜柱：Spherigel C18柱（200 mm×4.6 mm I.D.， 5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-水（19：81， v/v）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：266 nm;柱溫：室溫;進(jìn)樣量：20 μL。

二、 射干異黃酮提取工藝流程

等質(zhì)量的射干粉末，分別加入等體積的試劑（如甲醇，乙醇，重蒸水等），采用不同的提取方法進(jìn)行提?。ǔ?、冷浸、回流），比較其中一個(gè)變量因素時(shí)，其它各條件均保持一致。提取液依次經(jīng)過(guò)濾、濃縮、定容后，利用高效液相色譜儀測(cè)定鳶尾苷、野鳶尾苷等異黃酮的提取率。

三、 結(jié)果與討論

1、 高效液相色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用高效液相色譜儀分析射干粗提物時(shí)，先后嘗試了不同比例的甲醇-水（如40：60、36：44等）、乙腈-水（16：84、19：81、22：78等）作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)采用甲醇-水體系作為流動(dòng)相時(shí)，由于熱力學(xué)和可壓縮性因素的影響，各色譜峰峰形變寬，且保留時(shí)間較長(zhǎng);由于乙腈洗脫能力和溶解能力都較強(qiáng)，當(dāng)選擇乙睛-水=19：81作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm，流速為1.0 mL/min時(shí)，射干中異黃酮類化合物基本實(shí)現(xiàn)基線分離。

2、 不同提取方法對(duì)射干異黃酮提取率的影響

為考察不同提取方法對(duì)于射干異黃酮提取效率的影響，使用70%乙醇作為提取溶劑，分別采用冷浸提取24 h、超聲提取30 min、加熱回流提取1 h。提取液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，經(jīng)HPLC檢測(cè)?？梢园l(fā)現(xiàn)，相同的提取溶劑和時(shí)間，不同的提取方法對(duì)提取效率有顯著的影響。由峰面積的大小可以確定加熱回流時(shí)2種異黃酮的提取效率最高，冷浸的提取效率次之，超聲的提取效率最低，所以最佳的提取方法是回流。

3、不同提取溶劑對(duì)射干中異黃酮提取率的影響

為選擇合適的提取溶劑，考察不同提取溶劑對(duì)射干中異黃酮提取效率的影響。分別加入無(wú)水乙醇、水、無(wú)水甲醇作為提取溶劑，加熱回流提取1.0 h，提取液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，經(jīng)HPLC檢測(cè)。可以發(fā)現(xiàn)，相同的提取時(shí)間和方法，不同的提取溶劑對(duì)提取效率也有影響。由峰面積的大小可以確定提取射干中化學(xué)成分的最佳溶劑為無(wú)水甲醇，其次為乙醇，再次為水。但是因?yàn)榧状加卸荆圆捎靡掖夹Ч眯?/p>

4、不同濃度提取溶劑對(duì)射干中異黃酮提取率的影響

為了選擇合適的乙醇提取濃度，考察不同濃度的乙醇對(duì)射干中異黃酮提取效率的影響。分別采用無(wú)水乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇為溶劑加熱回流提取1.0 h，提取液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，用HPLC進(jìn)行分析。不難發(fā)現(xiàn)，相同的提取方法、提取時(shí)間和提取溶劑，不同濃度的提取溶劑對(duì)提取效率也有影響。根據(jù)峰面積的大小可以確定提取射干中異黃酮的最佳乙醇濃度為70%。

5、不同提取時(shí)間對(duì)射干中異黃酮提取率的影響

為考察提取時(shí)間對(duì)射干異黃酮提取率的影響，使用70%乙醇作為提取溶劑，分別加熱回流0.5 h、1 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h，提取液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，經(jīng)HPLC檢測(cè)。根據(jù)峰面積的大小發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取時(shí)間為1.0 h和1.5 h時(shí)，射干中異黃酮提取率最大，此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，異黃酮提取率反而有下降的趨勢(shì)。從節(jié)約時(shí)間的角度考慮，選擇每次1 h作為最佳的提取時(shí)間。

6、不同提取次數(shù)對(duì)射干中異黃酮提取率的影響

為考察提取次數(shù)對(duì)提取率的影響，使用70%乙醇作為提取溶劑，分別將加熱回流提取，每次1.0 h，提取液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，經(jīng)HPLC檢測(cè)。檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，相同的提取方法、提取時(shí)間和提取溶劑，隨著回流次數(shù)的不同，提取的效率有很大的差異。通過(guò)峰面積的大小可知，第一次提取時(shí)即可提出大部分的異黃酮，第二次與第三次的提取量相當(dāng)，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于第一次，從節(jié)約性的角度考慮，因此加熱回流提取兩次即可。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察影響射干中異黃酮提取率的提取方法、提取溶劑、不同濃度的提取溶劑、不同提取時(shí)間、不同提取次數(shù)，確定了射干中異黃酮的最優(yōu)提取工藝：70%的乙醇作為提取溶劑，加熱回流提取2次，每次的提取時(shí)間為1 h。

（作者單位：252000 山東省聊城市農(nóng)藥檢定所;252000 山東省聊城水務(wù)水質(zhì)檢測(cè)有限公司）