陳 婷

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院病理科，福建 泉州 362000)

臨床研究表明：N-myc下調(diào)基因2(NDRG2)屬于是一種抑癌候選基因，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在緊密的聯(lián)系[1]。而絲/蘇氨酸蛋白激酶2(AKT2)及其磷酸化蛋白(p-AKT2)在多數(shù)惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，但是在肝癌中的應(yīng)用研究較少[2]。因此，本文采用隨機(jī)病例選取方法進(jìn)行研究，探討NDRG2和AKT2及p-AKT2在肝癌病理組織中的應(yīng)用及與臨床病理的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇2016年4月～2018年3月治療的肝癌患者62例作為對象，男40例，女22例，年齡32～68歲，平均(45.81±5.77)歲；病例類型：肝細(xì)胞癌33例，肝管細(xì)胞性肝癌24例，混合型肝癌5例。Edmondson分級：Ⅰ級26例，Ⅱ級20例，Ⅲ級16例，Ⅳ級2例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①入組患者均符合肝癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；②均行手術(shù)治療，術(shù)中取病灶標(biāo)本；③能遵循醫(yī)囑完成相關(guān)治療、檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤、精神異常或術(shù)前給予放化療、免疫治療者；③合并精神異常、妊娠期或哺乳期者。

1.2方法

1.2.1NDRG2、AKT2 mRNA水平：①采用熒光定量PCR技術(shù)測定標(biāo)本NDRG2、AKT2 mRNA水平：分別取病灶組織、癌旁組織，經(jīng)PBS進(jìn)行沖洗后加入500 μl trizol吹打，使得組織充分溶解，加入500 μl trizol充分混合、均勻。將上述溶液放入體溫5 min下使得蛋白體充分解體，加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，常溫下放置2～3 min，15 min離心，速度12 000 rpm，獲得三層液體(上層為水相、中間層與下層為有機(jī)相)。取RNA沉淀，轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入0.5 ml異丙醇，充分混合后放置在-20℃冰箱中，10 min離心，速度為12 000 rpm，可見凝膠狀沉淀(即為RNA)。充分洗滌RNA，并加入250 μl DEPC與750 μl乙醇，利用乙醇完成沉淀的沖洗，5 min離心，速度為7 400 r/min，取沉淀放入工作臺上進(jìn)行20 min干燥。利用紫外分光度儀檢測RNA濃度并完成RNA提純(以Rnase作為空白對照)，在A260下測定吸光度值。采用Dnase酶處理RNA，處理完畢后放入冰箱中，備用。②PCR反應(yīng)：檢測NDRG2、AKT2 mRNA表達(dá)量，根據(jù)胃癌病灶組織設(shè)置相關(guān)引物，設(shè)定反應(yīng)條件：30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min，連續(xù)進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃下完成10 min延長。選擇獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，放入1.5%瓊脂凝膠進(jìn)行電泳，完畢后采用UVP凝膠圖像完成灰度值的測定，β-actin為內(nèi)對照[3-4]。

1.2.2NDRG2、AKT2及p-AKT2水平：采用Western Blot法測定標(biāo)本NDRG2、AKT2及p-AKT2水平。分別制作濃度為6%的積層膠和12%分離膠，每個組織蛋白濃度結(jié)果各上樣50 μg，轉(zhuǎn)膜2.5 h，電壓100 V，完成組織麗春紅染色，5%脫脂奶粉下進(jìn)行1 h封閉，加入一抗，放置在塑料袋中進(jìn)行15 h孵育，溫度4℃，復(fù)溫到室溫，緩慢搖晃1 h，加入三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液5 min，洗膜4次后加入二抗，搖床上振蕩，常溫下1 h孵育，PBS下5 min沖洗，連續(xù)進(jìn)行4次洗膜。在暗室中利用ELC發(fā)光底物硝酸纖維素進(jìn)行5 min顯影，X光底片下進(jìn)行20 s壓片，25 s顯影，3 min定影，清水沖洗后晾干，最后利用數(shù)碼相機(jī)對結(jié)果進(jìn)行拍照[5]。

1.3統(tǒng)計分析:采用SPSS18.0軟件處理，計數(shù)資料行χ2檢驗，采用率(%)表示，計量資料行t檢驗，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同組織NDRG2、AKT2 mRNA水平比較:肝癌病灶組織與癌旁組織AKT2 mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；肝癌病灶組織中NDRG2 mRNA水平，低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1不同組織NDRG2、AKT2 mRNA水平比較

組織類型例數(shù)NDRG2 mRNAAKT2 mRNA病灶組織620.84±0.121.23±0.26癌旁組織621.60±0.211.22±0.27t值8.51713.251P值0.0000.000

2.2兩組NDRG2、AKT2及p-AKT2水平比較：肝癌病灶組織中NDRG2蛋白水平，低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；肝癌病灶組織中AKT2、p-AKT2蛋白水平，高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2兩組NDRG2、AKT2及p-AKT2水平比較

組織類型例數(shù)NDRG2AKT2p-AKT2病灶組織626.71±0.6714.24±2.4118.50±1.25癌旁組織629.47±1.249.28±0.6812.49±1.08t值10.3955.6819.386P值0.0000.0000.000

3 討論

NDRG2屬于是一種低表達(dá)基因，在多種惡性腫瘤或細(xì)胞系中表達(dá)水平相對較低，但在人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦皮質(zhì)、白質(zhì)與神經(jīng)核中表達(dá)水平相對較高，在骨骼干細(xì)胞或精細(xì)胞中表達(dá)水平相對較低，能直接參與細(xì)胞的增殖[6]。臨床研究表明，NDRG2能抑制惡性腫瘤細(xì)胞系，是一種抑癌基因。國內(nèi)學(xué)者研究表明，NDRG2在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平相對較低或不表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸存在緊密的聯(lián)系。而PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。本研究中，肝癌病灶組織與癌旁組織AKT2 mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；肝癌病灶組織中NDRG2 mRNA水平，低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；肝癌病灶組織中NDRG2蛋白水平，低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；肝癌病灶組織中AKT2、p-AKT2蛋白水平，高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明NDRG2與AKT2、p-AKT2蛋白在肝癌組織中表達(dá)異常，均能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，能反映疾病的嚴(yán)重程度，與臨床病理具有相關(guān)性。因此，臨床上加強(qiáng)AKT2、p-AKT2、NDRG2測定能評估患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療，利于患者恢復(fù)。

綜上所述，NDRG2在肝癌組織中呈低表達(dá)，而p-AKT2在肝癌組織中呈高表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)性，均能參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。