陳 直，宋 偉, 朱永娜，劉 茜

(1.蚌埠醫(yī)學院，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000)

慢性根尖肉芽腫是一種最常見的慢性根尖疾病。該疾病以炎性骨組織破壞吸收為特征[1]。促炎因子和抗炎因子(如細胞白介素-17，白細胞介素-27及白細胞介素-12等)在慢性根尖肉芽腫的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[2]。

白細胞介素-35(IL-35)是一種新發(fā)現(xiàn)的、主要由調(diào)節(jié)性T細胞(Tegulatory T cells, Tregs)分泌的免疫調(diào)節(jié)因子，該因子隸屬于白細胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)家屬[3]。文獻報道Tregs可以抑制慢性根尖周炎中白細胞介素-17(Interleukin-17, IL-17)的分泌，抑制根尖組織炎性反應(yīng)及組織破壞[4]。IL-12家族成員還包括白細胞介素-27(Interleukin-27，IL-27)、白細胞介素-12(Interleukin-12, IL-12)及白細胞介素-23(Interleukin-23, IL-23)三種炎性因子。研究發(fā)現(xiàn)IL-12家族中的IL-27、IL-12及IL-23調(diào)節(jié)慢性根尖周病發(fā)生進展，其中IL-12及IL-27發(fā)揮雙重作用[2]。

Tregs及IL-12家族炎性因子調(diào)節(jié)慢性根尖周炎的發(fā)生發(fā)展，扮演重要角色。但是，IL-35作為由Tregs分泌的IL-12家族的新成員，其慢性根尖周炎中的作用尚不清楚。因此，本課題探討IL-35在慢性根尖肉芽腫中的表達，分析其臨床意義，為促進該疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018年3月～2018年5月就診于蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院、臨床及影像學診斷為慢性根尖肉芽腫的患者。入選標準：①年齡在18～65歲；②無其他口腔疾病和全身系統(tǒng)性疾?。虎?個月內(nèi)未服用抗生素和其他激素類藥物；④X線診斷為慢性根尖肉芽腫；⑤有拔牙指征，且無拔牙禁忌證， 篩選患者并收集拔除患牙的根尖軟組織。另選取同期在本院因拔除阻生牙時切除的健康軟組織5例為對照組，患者符合納入標準的①②③⑤。所有操作均取得患者知情同意，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1HE染色:將收集到的軟組織用等離子水沖洗3 min，去除多余水分后，用4%福爾馬林固定24 h，然后石蠟包埋。將蠟塊切成4 μm厚的連續(xù)切片，按HE染色步驟進行染色。封片后，倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)判斷標準判定標本類型。根尖肉芽腫病理判斷標準為可見以大量炎性細胞、毛細血管和成纖維細胞增生為主的炎性肉芽組織。篩選出影像學和病理診斷一致并符合要求的標本，最終獲得試驗組8例。

1.2.2免疫組織化學:根據(jù)SP步驟，將符合試驗標準的石蠟包塊切成4 μm厚的連續(xù)切片。常規(guī)二甲苯脫蠟乙醇梯度脫水，等離子水漂洗。取出切片置于3%的過氧化氫溶液中充分滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水沖洗3次，3 min/次。然后將切片浸在0.01 M檸檬酸鈉緩沖液中加熱用于熱修復(fù)抗原，冷卻至室溫后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)充分洗滌。滴加封閉液，室溫20 min后去除多余液體，滴加一抗50 μl避光放于4℃恒溫箱12 h(一抗1∶400稀釋)?；謴?fù)至室溫后滴加羊抗兔二抗50 μl在37℃恒溫箱孵育30 min，用PBS充分洗滌。然后滴加鏈霉親和素-POD工作液，于37℃恒溫箱中孵育30 min，PBS充分洗滌，將滴加DAB顯色液滴，鏡下控制染色時間，待充分染色后，蒸餾水洗去多余液體；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，中性膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。用PBS緩沖液代替一抗孵育切片作為陰性對照組。

陽性試驗結(jié)果判斷的標準為細胞核、細胞質(zhì)或細胞膜上出現(xiàn)黃色或棕色顆粒。每張切片隨機選取5個視野進行拍照，并用Image-J軟件進行分析。

1.3統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示。采用獨立樣本t檢驗分析比較兩組中IL-35的表達情況。所有檢驗均以α=0.05作為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1兩組HE結(jié)果比較：試驗組見大量炎性細胞浸潤，大量成纖維細胞增生(見圖1A)。對照組見大量纖維組織及少量炎性細胞(見圖1B)。

圖1 兩組患者病理切片圖

2.2IL-35的表達情況:試驗組和對照組均可見IL-35表達(如圖2)。試驗組IL-35表達量為0.422±0.044，對照組則為0.086±0.011，經(jīng)t檢驗，試驗組IL-35表達高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(t=16.37，P<0.05)。

圖2 IL-35在實驗組和對照組均表達

3 討論

慢性根尖肉芽腫是引起頜骨破壞的一種常見炎性疾病，根管系統(tǒng)內(nèi)的細菌感染引起宿主一系列的免疫炎性反應(yīng)，這一反應(yīng)過程中的炎性細胞、促炎因子(如中性粒細胞、IL-17、白細胞介素-1)等導(dǎo)致根尖軟硬組織的破壞[5]。此外，在根尖肉芽腫的發(fā)生過程中機體啟動保護機制，如調(diào)節(jié)性T細胞增加，抗炎因子的分泌增多等[6-7]。IL-35是IL-12家族的最新成員，在炎性疾病中發(fā)揮抗炎作用。但是，IL-35是否在慢性根尖肉芽腫中表達尚不清楚。因此，本課題探索IL-35在慢性根尖肉芽腫中的表達情況，以期促進該疾病的治療。

本課題發(fā)現(xiàn)在慢性根尖肉芽腫中IL-35的表達量為0.422±0.044，正常對照組中的表達量為0.086±0.011，前者表達較高。Aksha等人用RT-PCR比較了IL-35在慢性牙周炎及侵襲性牙周炎中的表達情況，研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者的牙齦組織中該因子的表達量高于侵襲性牙周炎患者的牙齦組織，正常牙齦組織中IL-35的表達量最低[8]。劉迪昕等人用ELISA研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者血清和齦溝液中IL-35的表達較健康者血清和齦溝液中的表達高[9]。本研究中IL-35在慢性根尖肉芽腫的表達較高，與之前牙周炎中IL-35表達較高結(jié)果一致，可能因為慢性根尖肉芽腫和牙周炎相同均伴隨炎性骨吸收。

IL-35主要由誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細胞分泌。Tregs能夠抑制炎性反應(yīng)，抑制疾病的進展。體外研究發(fā)現(xiàn)Tregs在骨組織代謝中，抑制破骨細胞的形成，抑制骨組織的吸收破壞。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，Tregs能夠抑制類風濕性關(guān)節(jié)中骨組織破壞[10]。Carolina等人發(fā)現(xiàn)在牙周炎進展過程中，向病損組織遷移的Tregs增多，同時隨著該細胞的增多，牙周骨組織破壞減緩，表明該細胞能夠減輕牙周炎炎性反應(yīng)及骨組織吸收[11]。2016年學者通過鼠實驗性根尖周炎模型，探索Tregs在慢性根尖周炎中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著病情的發(fā)展，Tregs 量逐漸增加，而抑制 Tregs后，與對照組相比，其在疾病誘導(dǎo)的第14天和第21天根尖病損直徑較大。在野生型鼠根尖周炎中Tregs數(shù)量和根尖病損程度成反相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)在抑制鼠Tregs后，除了根尖周病損增大外，同時促炎因子(如IL-17、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1)分泌增高，Treg 標志分子(如IL-10)及組織愈合分子的降低，可見Tregs 細胞在根尖炎進展過程中發(fā)揮抑制疾病進展，促進組織愈合的作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn)根尖肉芽腫中IL-35的表達較正常對照組高，可能與分泌IL-35的 Tregs在慢性根尖周炎增多相關(guān)。 IL-35與Tregs在慢性根尖肉芽腫的關(guān)系還需要進一步的研究。

IL-35在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮抗炎作用，而IL-17是由Th17細胞分泌的一種重要的促炎因子，因此學者探索了IL-35與IL-17的關(guān)系。KochetkovaI等人在2010年發(fā)現(xiàn)IL-35通過刺激IL-10依賴的CD4陽性T細胞間接抑制IL-17的分泌[12]。后來Okada等人在2017年發(fā)現(xiàn)IL-35能夠通過抑制Th17的轉(zhuǎn)錄因子，直接抑制該因子的分化，抑制IL-17的分泌[13]。在炎性反應(yīng)疾病中，IL-35通過抑制Th17細胞的應(yīng)答，抑制IL-17的釋放發(fā)揮其抗炎作用。之前的研究發(fā)現(xiàn)在鼠實驗性根尖周炎及人根尖周炎中均發(fā)現(xiàn)IL-17的表達，IL-17在根尖周炎的急性期表達升高，IL-17在慢性根尖炎的發(fā)生進展中扮演重要角色[14]。在慢性根尖肉芽腫中，IL-35可能通過抑制IL-17，發(fā)揮其抑制作用，但還要進一步研究。

綜上所述，慢性根尖肉芽腫中IL-35的表達較高，IL-35可能在該疾病中發(fā)揮抑制根尖區(qū)組織炎性反應(yīng)，抑制組織破壞的作用。但本實驗有實驗方法單一，樣本量的不足。