楊 靖，宋夢(mèng)坤，楊鵬飛，何春雨，鐘聞?dòng)?，賈春曉，毛多斌*

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草科學(xué)與工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道136號(hào) 450001

2.鄭州輕工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道136號(hào) 450001

清（青）香香韻是具備清新、新刈草或綠色植物香氣的一種香韻［1］，其中，青香韻通常被描述為新鮮采割的青草所表現(xiàn)的氣味，清香韻則側(cè)重表達(dá)氣息的新鮮感覺，通常二者被視為同一種香韻，是突出卷煙清香型風(fēng)格的特征香韻。近年來，國(guó)內(nèi)外的研究表明，煙葉或煙氣中具有清香特征的物質(zhì)主要是中性香氣成分，其與質(zhì)體色素、西柏三烯類等降解物有關(guān)［2-5］。杜詠梅等［6］研究發(fā)現(xiàn)，清香型煙草的二氫大馬酮、香葉基丙酮等中性揮發(fā)性成分與濃香型煙草存在差異。目前，烤煙煙葉理化指標(biāo)與煙葉清香型風(fēng)格的相關(guān)分析已有較多報(bào)道［7-8］，但香氣成分分析結(jié)果無法與卷煙感官品質(zhì)較好地關(guān)聯(lián)。閾值技術(shù)是篩選復(fù)雜體系關(guān)鍵香氣活性成分、表征香氣風(fēng)格特征、重構(gòu)香氣模型等方面的熱點(diǎn)技術(shù)之一，近年來在食品科學(xué)研究領(lǐng)域已有大量研究報(bào)道［9-13］，在煙草科學(xué)研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外也先后開始進(jìn)行相關(guān)研究。張啟東等［14］、遲廣俊等［15］、冒德壽等［16］利用滋味活性值（Taste active value，TVA）分析了煙葉或煙氣中關(guān)鍵酸味物質(zhì)和甜味物質(zhì)。Leffingwell等［17］、朱浩等［18］利用香氣活力值（OAV）技術(shù)研究了香料煙中關(guān)鍵酸性香氣成分和卷煙主流煙氣總粒相物中的煙熏香成分。而目前基于OAV判斷煙草香氣成分對(duì)凸顯卷煙風(fēng)格特征貢獻(xiàn)大小的研究鮮有報(bào)道，因此，以玉溪C3F和許昌C3F煙葉為研究對(duì)象，通過測(cè)定清香成分在主流煙氣中的釋放量，結(jié)合其嗅覺閾值計(jì)算獲得OAV，通過比較OAV的大小判定其對(duì)清香香韻的貢獻(xiàn)，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)比分析這些清香成分對(duì)兩種煙葉整體清香香韻貢獻(xiàn)度的差異，以期為定量表征煙葉原料香氣風(fēng)格特征提供新的技術(shù)手段和理論支撐。

1.材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2016年河南許昌復(fù)烤煙葉C3F，2016年云南玉溪復(fù)烤煙葉C3F（簡(jiǎn)稱為許昌C3F和玉溪C3F），由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司駐馬店卷煙廠卷制為樣品卷煙，主要技術(shù)指標(biāo)為煙支總長(zhǎng)84 mm（59 mm+25 mm），煙支質(zhì)量0.91 g/支，接裝紙不打孔，焦油量10.1 mg/支，煙堿量0.86 mg/支，一氧化碳量11.9 mg/支。樣品卷煙于4℃下保存。

二氯甲烷、正己烷、異丙醚、異丙醇（色譜純），氫氧化鈉、鹽酸、無水硫酸鈉（分析純）（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；11種標(biāo)準(zhǔn)品：6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-大馬酮、二氫大馬酮、3-乙?；拎ぃā?8%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司），乙酸糠酯、壬醛、癸醛（≥98%，北京百靈威科技有限公司），2-乙基己醇［≥99%，阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司］，氧代異佛爾酮（≥99%，Chromadex公司），枯茗醛（≥97%，北京百靈威科技有限公司），香葉基丙酮（≥98%，東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；內(nèi)標(biāo)：2,6-二氯甲苯、硝基苯、反-2-己烯酸（≥98%，北京百靈威科技有限公司）。

RM20H型20孔道吸煙機(jī)（德國(guó)Borgwaldt-KC公司）；Waters 600半制備型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；7890/5977 B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；MS205DU電子天平（感量0.000 01 g，瑞士Mettler-Toledo公司）；同時(shí)蒸流萃取裝置（鄭州科技玻璃儀器廠）；DLSB-1020型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州國(guó)瑞儀器有限公司）；HZ-2型電熱恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備總廠）；威瑞牌MY-1000 ML型可調(diào)控溫電熱套（山東甄城振興儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

（2）堿性組分。TPM的捕集方式和條件同酸性組分，每個(gè)濾片捕集20支卷煙，10個(gè)濾片為1組。采用文獻(xiàn)［22］中的方法萃取分離獲得堿性組分，無水硫酸鈉干燥后過濾，濾液中加入100 μL硝基苯（濃度為65.92 mg/mL），濃縮至1 mL后備用。

（3）中性組分。TPM的捕集方式和條件同酸性組分，每個(gè)濾片捕集20支卷煙，10個(gè)濾片為1組。采用文獻(xiàn)［23］中的方法萃取分離獲得中性組分，無水硫酸鈉干燥后，將得到的組分用半制備型HPLC分離，分離條件參照文獻(xiàn)［24］，分離后依據(jù)12個(gè)流分的定性結(jié)果合并為3個(gè)流分，分別加入100 μL 2,6-二氯甲苯（濃度為75.39 mg/mL），濃縮至1 mL后備用。

1.2.2 主流煙氣中香氣物質(zhì)的定性分析

對(duì)1.2.1節(jié)中獲得的酸性、堿性、中性組分濃縮液分別進(jìn)行GC-MS定性分析。GC-MS的分析條件為：

1.2.3 主流煙氣中清香成分的確定及定量分析

根據(jù)定性結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)［1，25-30］確定清香成分，氣味描述參考文獻(xiàn)［25，30］。使用內(nèi)標(biāo)法通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)主流煙氣中的清香成分進(jìn)行定量，樣品前處理和GC-MS分析條件同1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)。

1.2.4 各清香成分嗅覺閾值的確定和OAVs的計(jì)算

清香成分的嗅覺閾值（Olfactory threshold）數(shù)據(jù)來源于相關(guān)文獻(xiàn)［31-32］，嗅覺閾值以參考文獻(xiàn)中香氣物質(zhì)在水中的閾值為主。OAVs為卷煙樣品中清香成分在TPM中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其嗅覺閾值的比值。

1.2.5 2種烤煙煙葉的質(zhì)量風(fēng)格特色感官評(píng)價(jià)

由至少7名全國(guó)評(píng)煙委員會(huì)委員或全國(guó)調(diào)香委員會(huì)委員組成評(píng)價(jià)小組，按YC/T 530—2015［33］的感官評(píng)價(jià)方法對(duì)2種香型烤煙煙葉的質(zhì)量風(fēng)格進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 主流煙氣TPM中香氣成分的定性結(jié)果

主流煙氣TPM中的各組分經(jīng)定性分析后共得到69種香氣成分，GC-MS總離子流色譜圖和定性結(jié)果見圖1～圖3和表1～表3。其中：酸性組分中香氣成分共20種（圖1和表1）；堿性組分中香氣成分共10種（圖2和表2）；中性組分中香氣成分共39種（圖3和表3）。

圖1 酸性組分的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of acidic components

圖2 堿性組分的總離子流色譜圖Fig.2 TIC chromatogram of basic components

圖3 中性組分中流分Ⅰ～Ⅲ的總離子流色譜圖片段圖Fig.3 Partial TIC chromatograms of fractionⅠ-Ⅲ in neutral components

表1 酸性組分的定性結(jié)果Tab.1 Qualitative results of acidic components

表2 堿性組分的定性結(jié)果Tab.2 Qualitative results of basic components

表3 中性組分的定性結(jié)果Tab.3 Qualitative results of neutral components

表3（續(xù)）

2.2 主流煙氣TPM中清香成分的確定

根據(jù)2.1中的定性結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)［1，25-30］確定11種清香成分，氣味描述參考文獻(xiàn)［25，30］，氣味描述及離子選擇參數(shù)見表4。由表4可知，11種致香成分雖然歸屬于清香香韻，但并非都是單純的青香，如β-大馬酮和二氫大馬酮同時(shí)兼具花香特征，也從另一面反映了“卷煙清香”這一概念本身的復(fù)雜性。

表4 主流煙氣中清香成分的確定及各清香成分的選擇離子參數(shù)Tab.4 Identification and selected ion parameters of fresh aroma components in mainstream smoke

2.3 清香成分定量分析的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

主流煙氣中清香成分定量分析的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果見表5。由表5可知，在線性范圍內(nèi)工作曲線線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢測(cè)限為1.02～4.69 μg/kg，定量限為3.06～14.07 μg/kg，平均回收率為65.63%～87.36%，RSD為1.13%～4.05%?？梢姡摲椒`敏度較高，精密度較好，可以滿足檢測(cè)要求。

2.4 2種香型烤煙煙葉主流煙氣TPM中11種清香成分的分布

2種香型烤煙煙葉主流煙氣TPM中，11種清香成分的單支卷煙釋放量及其在主流煙氣TPM中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表6。可以看出：①玉溪C3F主流煙氣TPM中，11種清香成分的總釋放量為5.16 μg/支，其中，3-乙?；拎ず拖闳~基丙酮的釋放量較高，分別達(dá)到2.76和1.23 μg/支，占11種清香成分總釋放量的53.48%和23.84%；其次是6-甲基-5-庚烯-2-酮和二氫大馬酮，分別為0.35和0.24 μg/支，占總釋放量的6.78%和4.65%。②許昌C3F主流煙氣TPM中，11種清香成分總釋放量為4.47 μg/支，其中，3-乙?；拎ず拖闳~基丙酮的釋放量較高，分別達(dá)到3.15和1.01 μg/支，占11種清香成分總釋放量的70.48%和22.60%；其次是2-乙基己醇和氧代異佛爾酮，分別為0.08和0.07 μg/支，占總釋放量的1.79%和1.57%。③11種清香成分在玉溪C3F中的總釋放量（5.16 μg/支）高于許昌C3F（4.47 μg/支）；在2種煙葉煙氣中，3-乙?；拎ず拖闳~基丙酮釋放量均較高，3-乙?；拎ぴ谠S昌C3F中的占比更高，香葉基丙酮?jiǎng)t差異不大；玉溪C3F中釋放量較高的6-甲基-5-庚烯-2酮和二氫大馬酮，在許昌C3F中的釋放量卻比較低，這種差異可能是玉溪C3F煙葉比許昌C3F煙葉清香風(fēng)格更加突出的重要原因；11種清香成分在卷煙主流煙氣TPM中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布規(guī)律類似于其單支卷煙的釋放量情況。

表5 各成分的工作曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限、定量限、RSDs及回收率（n=5）Tab.5 Linear equation，correlation coefficient，linear range，limit of detection，RSD and recovery of each component（n=5）

表6 濃香型和清香型烤煙煙葉主流煙氣中11種清香成分釋放量的分布Tab.6 Levels of 11 fresh aroma components in mainstream smoke of flue-cured tobacco of robust and fresh flavor types

2.5 各清香成分OAVs及與煙葉感官質(zhì)量的相關(guān)性

在食品風(fēng)味分析中，通常認(rèn)為OAV不小于1的化合物對(duì)整體香氣的呈現(xiàn)有貢獻(xiàn)，且化合物OAV越大，其對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)度就越大［9］。表7為2種香型烤煙煙葉主流煙氣TPM中11種清香成分的OAV結(jié)果。

在2種煙葉的11種清香成分中，除2-乙基己醇外其余10種成分的OAV均大于1，說明這10種成分對(duì)煙氣清香香韻有貢獻(xiàn)作用。在玉溪C3F中，10種清香成分的OAV介于8.20～8.67×106之間，總OAV 為 8.91×106，β-大馬酮的OAV（8.67×106）最高，氧代異佛爾酮（8.20）最低，最高值和最低值相差高達(dá)6個(gè)數(shù)量級(jí)，表明不同成分對(duì)清香香韻的貢獻(xiàn)度有很大差異；主流煙氣中β-大馬酮和二氫大馬酮的釋放量之和為0.35 μg/支，僅占總釋放量的6.78%，但由于其嗅覺閾值最小，因此2種香氣成分的OAV之和（8.88×106）幾乎等于總OAV；盡管3-乙?；拎ず拖闳~基丙酮2種香氣成分的釋放量占總釋放量的77.32%，但其嗅覺閾值均較大，因此其OAV之和僅占總OAV的0.02%。以上分析表明，β-大馬酮和二氫大馬酮在彰顯煙氣清香香韻時(shí)起著更重要的作用。許昌C3F的OAV分布規(guī)律與玉溪C3F一致。

表7 主流煙氣中11種清香成分的OAVsTab.7 OAVs of 11 fresh aroma components in mainstream smoke

為了明確2種烤煙煙葉的風(fēng)格特征差異，對(duì)其感官質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果見表8。由表8可知，玉溪C3F煙葉的清甜香突出、清香明顯，而許昌C3F煙葉焦甜香突出。造成這種感官差異的原因之一是煙葉中清香成分OAV之間的差異，對(duì)比2種烤煙煙葉10種清香成分的OAV總和，發(fā)現(xiàn)玉溪C3F的總OAV為8.91×106，是許昌C3F總OAV的5倍。有研究表明［34］，OAV相差3倍以上即可明顯察覺到感官質(zhì)量的差異，因此可以判定玉溪C3F煙葉的清香更明顯，這一結(jié)果與煙葉感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。另一個(gè)原因是，2種烤煙煙葉風(fēng)格特征的差異可能不是由于這11種清香成分所致，而是由于許昌煙葉烤甜香的香氣成分OVAs值更高，掩蓋了清香成分。綜上可知，基于香氣活力值來判定烤煙煙葉風(fēng)格特征是可行的。

表8 濃香型和清香型烤煙煙葉風(fēng)格特征評(píng)價(jià)結(jié)果的比較Tab.8 Sensory evaluation results of style characteristics of flue-cured tobacco of robust and fresh flavor types

3 結(jié)論

11種清香成分在玉溪C3F和許昌C3F煙葉主流煙氣中的總釋放量分別為5.16和4.47 μg/支，其中，釋放量最高的3-乙酰基吡啶對(duì)煙氣清香香韻的貢獻(xiàn)度較低，而釋放量相對(duì)較低的β-大馬酮和二氫大馬酮的OAV較大，在彰顯煙氣清香香韻方面有重要貢獻(xiàn)。除OAV小于1的2-乙基己醇外，其余10種清香成分在玉溪C3F煙葉主流煙氣中的總OAV為8.91×106，是許昌C3F煙葉的5倍，這可能是玉溪煙葉清香風(fēng)格特征更加突出的重要原因。

傳統(tǒng)方法中依據(jù)香氣成分含量來判定其對(duì)煙葉風(fēng)格特征的貢獻(xiàn)度，而本文中建立的基于香氣活力值的判定新方法，從含量和閾值兩個(gè)維度對(duì)煙氣體系中香氣成分的貢獻(xiàn)度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為定量表征煙葉原料香氣風(fēng)格特征提供了新的技術(shù)手段，為中式卷煙配方技術(shù)的深入研究提供了理論參考。但由于煙葉或煙氣的香氣成分種類多，本文中僅對(duì)清香香韻中11種成分的OAV進(jìn)行了測(cè)定，沒有考慮煙氣復(fù)雜體系中各香韻之間的交互作用，在今后的研究中將對(duì)煙葉或煙氣中更多的香氣成分OAV進(jìn)行測(cè)定，考察其對(duì)卷煙香氣的貢獻(xiàn)度，以更加全面、客觀地反映煙葉風(fēng)格特征與香氣成分之間的關(guān)系。