張馨蕓，林慧嬌，李 欣，敬 舒，孫 微，蔣維海，王春梅，孫靖輝，李 賀，陳建光,

（1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132013）

統(tǒng)計(jì)資料表明，我國(guó)目前有半數(shù)以上的人群處于經(jīng)常疲勞的狀態(tài)，在城市人口中已占70%[1]。氧化應(yīng)激損傷是疲勞產(chǎn)生的主要原因之一[2-5]，以保護(hù)機(jī)體氧化損傷為靶點(diǎn)的抗疲勞產(chǎn)品，尤其是中藥抗疲勞保健食品日益受到人們的關(guān)注。五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill）是木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，其主要活性成分為多糖、木脂素等[6-7]。目前，關(guān)于五味子多糖具有抗疲勞及耐缺氧作用的報(bào)道較多[8-10]，而五味子木脂素的相關(guān)研究較少。前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子總木脂素能顯著提高小鼠的抗疲勞能力[11-12]，但其中發(fā)揮主要作用的活性成分并未知曉。五味子酯甲（schisantherin A，SCA）是五味子木脂素的主要單體化合物成分，已有研究證實(shí)SCA具有較強(qiáng)的抗氧化功能[13-15]，但關(guān)于其抗疲勞作用的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察SCA對(duì)小鼠的抗疲勞作用及其與Nrf2/ARE抗氧化通路的相關(guān)機(jī)制，以驗(yàn)證五味子總木脂素抗疲勞作用的主要活性成分，為開發(fā)輔助抗疲勞功能的藥物及保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量（19f 2）g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（吉）-2016-0003。

SCA 四川省維克奇生物科技有限公司；吐溫20（分析純） 天津永大試劑公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、乳酸（lactic acid，LA）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒、肝糖原（liver glycogen，LG）試劑盒、肌糖原（muscle glycogen，MG）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）試劑盒 南京建成生物工程研究所；HCl-Tris、過硫酸銨、30%丙烯酰胺、甘氨酸、四甲基乙二胺 北京鼎國(guó)試劑公司；脫脂奶粉 美國(guó)BD公司；Keap1、Nrf2、HO-1 武漢ABclone公司；電化學(xué)發(fā)光（electro-chemiluminescence，ECL）顯色液 美國(guó)Vazyme公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Western blot凝膠電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀 美國(guó)Bio-Rad 公司；全自動(dòng)多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；infinite M200全自動(dòng)酶標(biāo)儀 瑞士TECAN集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥

將120 只ICR小鼠隨機(jī)分為4 組：CON組：蒸餾水灌胃及靜坐實(shí)驗(yàn)；MOD組：蒸餾水灌胃及負(fù)重游泳訓(xùn)練；SCA（C）組：SCA（2.5 mg/kg）灌胃及靜坐實(shí)驗(yàn)； SCA（M）組：SCA（2.5 mg/kg）灌胃及負(fù)重游泳訓(xùn)練。各組小鼠每天給藥1 次（0.1 mL/10 g）。

1.3.2 動(dòng)物造模方案

靜坐實(shí)驗(yàn)，不施加其他外界刺激干擾，不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，保持小鼠正?；顒?dòng)狀態(tài)。負(fù)重游泳訓(xùn)練，將小鼠置于（15f 2）℃、水面高度20 cm的塑料容器中，第一天30 min，第二天45 min，然后，每天60 min，每周訓(xùn)練5 d。游泳訓(xùn)練第2～6周每天保持1 h，負(fù)重為體質(zhì)量的10%。每周稱量體質(zhì)量，并且相應(yīng)地增加負(fù)荷。

1.3.3 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

在末次給予藥物30 min之后，進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)（方法同1.3.2節(jié)），至小鼠沉于水面下10 s后不能浮出水面的時(shí)間作為力竭游泳時(shí)間[16]。

1.3.4 小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

在末次給予藥物30 min之后，進(jìn)行疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)（轉(zhuǎn)速30 r/min）。正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練3 次，開始記錄小鼠由于肌肉疲勞產(chǎn)生后，從轉(zhuǎn)棒上跌下的時(shí)間[17]。

1.3.5 SCA對(duì)小鼠體內(nèi)疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定

在末次給予藥物30 min之后，小鼠不負(fù)重游泳60 min（溫度（15f 2）℃），休息60 min后進(jìn)行摘眼球取血，制備血清。采血后即刻取小鼠的肝臟，用生理鹽水漂洗后濾紙吸干，備用。檢測(cè)血清中BUN、LA、LDH、CK的水平以及肝臟、肌肉中LG、MG的含量。

1.3.6 SCA對(duì)小鼠體內(nèi)氧化相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定

取1.3.5節(jié)中制備的血清，按照試劑盒提供的方法檢測(cè)MDA、8-OHdG水平和SOD、GSH-Px活力。

1.3.7 Western blot法檢測(cè)血清中Keap1、Nrf2及HO-1的表達(dá)情況

在末次給予藥物30 min之后，小鼠不負(fù)重游泳60 min（溫度（15f 2）℃），休息60 min后，每組取3 只小鼠肝組織，冰上加入裂解液裂解1 h，離心后取上清液。測(cè)定肝組織蛋白濃度（二喹啉甲酸法[18]），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離Keap1、Nrf2、HO-1蛋白。電轉(zhuǎn)移至偏聚氟乙烯膜（2 h），封閉1 h（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的TBST緩沖液）。室溫孵育后棄去封閉液，分別加入一抗Keap1（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000），4 ℃溫育過夜后使用TBST洗5 次，每次5 min。二抗（1∶2 000）室溫溫育1 h，TBST洗5 次，每次5 min，ECL顯影液顯色。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)觀察SCA對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響

負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1A），與CON組相比，MOD組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間極顯著縮短（P＜0.01），SCA（C）組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）；與MOD比較，SCA（M）組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。如圖1B所示，轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中，與CON組相比，MOD轉(zhuǎn)棒時(shí)間極顯著縮短（P＜0.01），SCA（C）組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），與MOD組比較， SCA（M）組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。

圖 1 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)（A）和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)（B）觀察SCA對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響（n＝ 15）Fig. 1 Effect of SCA on exercise endurance in mice by weight-bearing swimming test (A) and rotarod test (B) (n = 15)

2.2 SCA對(duì)小鼠血清中BUN、LA濃度，LDH、CK活力以及肝臟與肌肉組織中LG、MG含量的影響

圖 2 SCA對(duì)疲勞小鼠血清中BUN（A）、LA（B）、LDH（C）、CK（D）水平的影響（n＝ 15）Fig. 2 Effect of SCA on the levels of BUN (A), LA (B), LDH (C) and CK (D) in serum of fatigue mice (n =15)

小鼠血清中B U N 濃度結(jié)果顯示（圖2 A），與CON組相比，MOD組小鼠血清BUN濃度極顯著增加 （P＜0.01），SCA（C）組小鼠血清BUN濃度顯著降低（P＜0.05）；與MOD組相比，SCA（M）組小鼠血清BUN濃度顯著降低（P＜0.05）。對(duì)各組小鼠血清LA濃度檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2B），與CON組相比，MOD組小鼠血清中LA濃度顯著增加（P＜0.05），SCA（C）組小鼠血清LA濃度降低，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與MOD組相比，SCA（M）組小鼠血清LA濃度極顯著下降（P＜0.01）。對(duì)各組小鼠血清LDH活力檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2C），與CON組相比，MOD組小鼠血清中LDH活力顯著升高 （P＜0.05），SCA（C）組小鼠血清LDH活力降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與MOD組相比，SCA（M）組小鼠血清LDH活力顯著下降（P＜0.05）。對(duì)各組小鼠血清CK活力檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2D），與CON組相比，MOD組小鼠血清CK活力升高（P＜0.05），SCA（C）組小鼠血清CK活力極顯著降低（P＜0.01）；與MOD組相比， SCA（M）組小鼠血清CK活力顯著降低（P＜0.05）。

圖 3 SCA對(duì)疲勞小鼠肝組織及肌肉組織中LG（A）及 MG（B）含量的影響（n＝ 15）Fig. 3 Effect of SCA on the contents of LG (A) and MG (B) in liver and muscle tissues of fatigue mice (n = 15)

由圖3A可知，與CON組相比，MOD組小鼠LG含量顯著降低（P＜0.05），SCA（C）組小鼠LG含量極顯著升高（P＜0.01）；與MOD組相比，SCA（M）組小鼠LG含量極顯著升高（P＜0.01）。對(duì)肌肉組織中MG含量檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3B），與CON組相比，MOD組小鼠MG含量顯著降低（P＜0.05），SCA（C）組小鼠MG含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與MOD組相比，SCA（M）組小鼠MG含量顯著升高（P＜0.05）。

2.3 SCA對(duì)小鼠血清中SOD、GSH-Px活力及MDA、8-OHdG水平的影響

圖 4 SCA對(duì)疲勞小鼠血清中SOD（A）、MDA（B）、GSH-Px（C）、8-OHdG（D）水平的影響（n=15）Fig. 4 Effect of SCA on the levels of SOD (A), MDA (B), GSH-Px (C), and 8-OHdG (D) in serum of fatigue mice (n = 15)

由圖4A可知，與CON組相比，MOD組小鼠血清中SOD活力極顯著下降（P＜0.01），SCA（C）組小鼠血清中SOD活力升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與MOD組相比，SCA（M）組小鼠血清中SOD活力極顯著升高 （P＜0.01）。各組小鼠血清中MDA濃度檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4B），與CON相比，MOD組小鼠血清中MDA濃度極顯著升高（P＜0.01），SCA（C）組小鼠血清中MDA濃度降低，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與MOD組相比，SCA（M） 組小鼠血清中MDA濃度顯著降低（P＜0.05）。各組小鼠血清中GSH-Px活力檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4C），與CON組相比，MOD組小鼠血清中GSH-Px活力降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，SCA（C）組小鼠血清中GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05）；與MOD組相比，SCA（M）組小鼠血清中GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05）。各組小鼠血清中8-OHdG質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4D），與CON組相比，MOD組小鼠血清中8-OHdG質(zhì)量濃度顯著升高 （P＜0.05），SCA（C）組小鼠血清中8-OHdG質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05）；與MOD組相比，SCA（M）組小鼠血清中8-OHdG質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05）。上述結(jié)果提示SCA可能通過提高小鼠機(jī)體的抗氧化能力而發(fā)揮抗疲勞作用。

2.4 SCA對(duì)疲勞小鼠肝組織中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)影響

圖 5 SCA對(duì)疲勞小鼠肝組織中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的 影響（n＝ 3）Fig. 5 Effect of SCA on the expression of Keap1, Nrf2 and HO-1 proteins in liver tissue of fatigue mice (n = 3)

本研究應(yīng)用Western blot方法從蛋白水平觀察各組小鼠Keap1、Nrf2、HO-1的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果如圖5所示，與CON組相比，MOD組小鼠肝組織Keap1蛋白表達(dá)水平上升，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平極顯著下降（P＜0.01）；SCA（C）組小鼠Keap1蛋白表達(dá)水平極顯著下降（P＜0.01），Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平極顯著上升（P＜0.01）；與MOD組相比，SCA（M）組Keap1蛋白表達(dá)水平極顯著下降（P＜0.01），Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平極顯著上升（P＜0.01）。進(jìn)一步驗(yàn)證了SCA有可能通過影響Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路中Keap1、Nrf2、HO-1表達(dá)而發(fā)揮相關(guān)作用。

3 討 論

運(yùn)動(dòng)耐力是評(píng)價(jià)受試動(dòng)物疲勞程度的重要指標(biāo)[19-20]。本研究應(yīng)用負(fù)重游泳及疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)兩種方法觀察SCA對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)立慢性疲勞模型SCA給藥組，即SCA（M）組，通過持續(xù)28 d的冷水負(fù)重游泳訓(xùn)練致小鼠慢性疲勞，用以對(duì)照觀察SCA給藥對(duì)小鼠慢性疲勞的影響；此外，本實(shí)驗(yàn)另設(shè)SCA未訓(xùn)練鼠給藥組即SCA（C）組，旨在觀察SCA對(duì)急性運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論在負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)還是疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中，SCA（M）及SCA（C）組小鼠均表現(xiàn)出明顯的機(jī)體抗疲勞作用，提示SCA能夠提高慢性疲勞及急性疲勞小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

BUN的濃度反映了蛋白質(zhì)分解代謝和身體對(duì)運(yùn)動(dòng)的耐受性，在劇烈運(yùn)動(dòng)的過程中，有氧能量供應(yīng)變?yōu)榧∪庵械臒o氧糖酵解，肌糖原被迅速消耗，產(chǎn)生大量的LA。LA在肌肉和血液中的累積會(huì)導(dǎo)致肌肉疲勞，而血清中LDH、CK的水平反映機(jī)體運(yùn)動(dòng)肌肉損傷的程度。MG在運(yùn)動(dòng)中直接提供能量，LG儲(chǔ)備能量，它們的氧化產(chǎn)物是運(yùn)動(dòng)能量的主要來源[21]。本研究結(jié)果顯示，SCA（M）組小鼠（與MOD組比較）及SCA（C）組小鼠（與CON組比較）血清BUN、LA、LDH及CK的水平均明顯降低，而肝糖原、肌糖原的濃度明顯增加。血清中LDH和CK的水平顯著降低，表明可能是由于SCA在強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)期間保護(hù)細(xì)胞免受損傷，且SCA加快了乳酸的分解，降低BUN濃度，延緩了疲勞的發(fā)生。MG與LG的含量增加為運(yùn)動(dòng)提供了更多的能量。進(jìn)一步證實(shí)SCA具有抗疲勞作用。

小鼠的劇烈運(yùn)動(dòng)加速自由基的產(chǎn)生，并誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷[22-24]。SOD是最主要的抗氧化酶，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起重要的作用；MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，是反應(yīng)自由基所致的機(jī)體損傷的重要指標(biāo)，其在血清中的含量隨著機(jī)體的疲勞累積而升高；GSH-Px作為機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能夠催化GSH變?yōu)镚SSG，還原有毒的過氧化物變?yōu)闊o毒的羥基化合物，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞不受過氧化物的損傷；8-OHdG可以反映機(jī)體細(xì)胞DNA氧化損傷的程度，該值越高提示DNA氧化損傷越嚴(yán)重[25-27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SCA可以提高疲勞小鼠血清中SOD、GSH-Px的活力，降低MDA、8-OHdG水平，提示SCA在慢性疲勞小鼠及急性疲勞小鼠中都表現(xiàn)出顯著的抗氧化作用，該結(jié)果與其他研究酯甲抗氧化功能的結(jié)果[28]是一致的。

Nrf2/ARE信號(hào)通路是參與機(jī)體抗氧化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)通路，Nrf2是細(xì)胞氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[29]。據(jù)報(bào)道，Nrf2缺陷小鼠表現(xiàn)出對(duì)肝臟組織中氧化應(yīng)激的極端易感性，通過改善體內(nèi)Nrf2的活性，可以有效地對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而減輕疲勞[30-31]。Keap1是Nrf2負(fù)調(diào)控因子，其自身的泛素化、磷酸化以及核穿梭機(jī)制都能影響Nrf2的活力[32]。HO-1是體內(nèi)較強(qiáng)的抗氧化劑，受Nrf2調(diào)控[33-34]。 本研究顯示SCA能夠下調(diào)慢性疲勞小鼠肝臟組織中Keap1蛋白的表達(dá)，并上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)，提示SCA可能通過調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號(hào)通路減輕氧化應(yīng)激以產(chǎn)生抗疲勞作用。后續(xù)研究將繼續(xù)探討SCA對(duì)肝臟以外其他組織中Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響，以進(jìn)一步探明SCA抗疲勞作用機(jī)制。

綜上，SCA對(duì)小鼠具有顯著的抗疲勞作用。該作用可能與其提高小鼠能量?jī)?chǔ)備、抗氧化能力及調(diào)節(jié)肝臟Nrf2/ARE抗氧化通路有關(guān)。