崔東影，席恩澤，徐境含，盛 雪，李夢寒，劉 洋，吳禹昊，許曉曦

（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

目前，由于我國母乳數(shù)據庫還不完善，嬰兒配方乳粉雖在營養(yǎng)成分上接近母乳，但免疫活性方面無法達到母乳水平[1]，因而最大程度地保持免疫蛋白在嬰兒配方食品中的生物活性功效成為乳品生產行業(yè)的關鍵技術[2]。強度高于巴氏殺菌的熱處理工藝技術會引起牛乳感官品質下降和營養(yǎng)成分的損失[3-4]，不僅降低了乳品質量，也可能會由于一些有害物質的產生導致產品不安全[5-6]。已有的嬰兒配方乳粉為安全性考慮均采用高溫殺菌，造成了蛋白質結構的改變[7]，一定程度上誘導了美拉德反應中間產物的形成，降低了嬰幼兒配方食品的消化吸收率[8]，由于蛋白質參與礦物質吸收，熱損傷的蛋白質可能會影響金屬離子的生物利用度[9]。有資料顯示，嬰幼兒乳粉在沖調過程中容易產生微生物污染的風險，尤其是阪崎腸桿菌對早產兒和低體質量兒會造成極大的危害[10]。嬰兒配方乳作為一種乳基液態(tài)配方食品，和其他嬰兒配方食品相比，具有安全、營養(yǎng)、哺喂方便等特點[11]。與市面現(xiàn)有的經超高溫滅菌的嬰兒配方產品相比，巴氏殺菌最大程度地保留了鮮牛乳及添加物質的免疫活性和天然營養(yǎng)。目前嬰兒配方乳粉中添加的乳鐵蛋白具有增強機體免疫、抗菌等生物活性[12-13]，但以往研究只停留在不同熱處理條件對其結構影響變化階段，有學者曾將不同熱處理條件下的乳鐵蛋白及乳鐵蛋白素對脾細胞的免疫促進作用[14]以及對癌細胞的促凋亡等功能性[15-16]進行了探討。但至今針對乳鐵蛋白在動物及嬰兒體內的生物活性，尤其是對免疫活性的探究仍為空白。本研究利用動物喂養(yǎng)實驗將實驗室自制巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳產品進行對比，用以探究兩類不同熱處理產品在大鼠生長及血液免疫指標方面的差異性，以期為研制出適合中國嬰兒生長發(fā)育需要的嬰兒配方乳提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

S D 大鼠（雄性、4 周齡、S P F 級、體質量90～110 g），購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2016-0006。

牛乳、脫鹽乳清粉、濃縮乳清蛋白粉 北京銀河乳業(yè)有限公司；乳糖、二十二碳六烯酸（docosahexeniic acid，DHA）、花生四烯酸（arachidonic acid，ARA） 羅蓋特生物營養(yǎng)品有限公司；低聚果糖、低聚半乳糖 保齡寶寶生物有限公司；?；撬帷⒑塑账?、左旋肉堿、肌醇、葉黃素、復配維生素、復配礦物質 北京金康普食品科技有限公司；乳鐵蛋白、乳白蛋白 天津銀河偉業(yè)進出口有限公司；大豆油、玉米油、葵花籽油 哈爾濱九三油脂有限公司；結構脂肪 益海嘉里有限公司； 卡拉膠、單甘酯 連云港友進食品添加劑技術開發(fā)有限 公司；以上材料均用于實驗室自制巴氏殺菌嬰兒配方乳。

白細胞介素-2（interleukin 2，IL-2）、IL-4、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、溶菌酶試劑盒 南京建成生物工程研究所；CD3-FITC、CD4-PE、 CD8a-PerCP單克隆抗體 杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；肝素鈉 上海惠世生化試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京Biotopped 公司。

1.2 儀器與設備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州丹瑞實驗儀器設備有限公司；JJ高壓均質機 廊坊市盛通機械有限公司； HZ實驗型超高溫殺菌機 上海輝展實驗設備有限公司；ACS30型電子秤 浙江風華科技有限公司； HBS-1096A酶標分析儀 南京德鐵實驗設備有限公司；755B紫外-可見分光光度計 上海精密儀器公司；3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物的處理和分組

選擇雄性S D 大鼠6 0 只，在實驗環(huán)境（室溫（21f 2）℃、室內相對濕度（32f 2）%、自然光照）下適應3 d，適應期間飼喂基礎飼料，自由進水，第4天早晨停止進食，3 h后稱體質量，按體質量分成4 組，每組15 只，單籠飼養(yǎng)，各組間的大鼠平均體質量無顯著差異（P＞0.05）；其中，第1組為基礎日糧組（對照組），第2組為市售常溫嬰兒配方乳I組（簡稱市售組I），第3組為市售常溫嬰兒配方乳II組（簡稱市售組II），第4組為巴氏殺菌嬰兒配方乳組（簡稱實驗組）。連續(xù)喂養(yǎng)4 周，記錄實驗開始第0、7、14、21、28天大鼠的體質量。參照GB 10765ü 2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》及GB 10769ü 2010《食品安全國家標準 嬰幼兒谷類輔助食品》進行飼料配制[17]。市售組和實驗組的基礎用料成分無明顯差別，各組飼料制作時的配料如表1所示。

表 1 大鼠飼料的組成Table 1 Rat diet compositions%

1.3.2 大鼠T細胞亞群的測定

于實驗第0、28天，每組隨機取3 只大鼠，乙醚麻醉后心臟采血，乙二胺四乙酸抗凝，吸取100 μL外周血于EP管中，分別加入1 μL的CD3-FITC、CD4-PE、 CD8a-PerCP單克隆抗體避光染色，反應30 min，每個樣品加入體積比1∶10的紅細胞裂解液2 mL，混勻，室溫靜置10 min后，3 000 r/min離心5 min[18]。小心棄去上清液，加入pH 7.4的2 mL PBS，洗滌2 次，棄上清液，加入400 μL PBS混勻，1 h內使用流式細胞儀檢測，計算CD3＋CD4＋T細胞與CD3＋CD8＋T細胞的比值。

1.3.3 大鼠免疫因子指標的測定

實驗開始后，在0、7、14、28 d空腹稱體質量，乙醚麻醉后心臟取血5 mL，4 ℃靜置12 h，析出血清后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清分裝于EP管中，于－20 ℃保存，根據IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、溶菌酶試劑盒說明書步驟測定相應指標水平。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計與分析

數(shù)據均使用Statistix 8軟件進行單因素方差分析 （P＜0.05表示差異顯著），并用Origin 8.5軟件作圖，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠體質量的影響

表 2 嬰兒配方乳對大鼠體質量變化的影響Table 2 Effect of infant formula on body mass change of rats

由表2可以看出，實驗開始前各組大鼠的體質量差異不顯著。飼喂兩周后，3 組嬰兒配方乳組與基礎日糧組相比差異顯著（P＜0.05）；3 周后，4 組大鼠的體質量均有不同程度的增長，實驗組與對照組和市售組相比差異顯著（P＜0.05），飼養(yǎng)4 周后，實驗組大鼠體質量達到最高，為189.11 g，表明巴氏殺菌嬰兒配方乳在促進幼年機體的生長發(fā)育方面明顯優(yōu)于市售常溫嬰兒配方乳。

2.2 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠血清細胞因子分泌水平的影響

2.2.1 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠血清IL-2分泌水平的影響

圖 1 嬰兒配方乳對大鼠IL-2分泌水平的影響Fig. 1 Effect of infant formula on the secretion of IL-2 in rats

IL-2是最早發(fā)現(xiàn)的細胞因子之一，又稱為T細胞生長因子，對T細胞的增殖、發(fā)育、分化、凋亡具有重要的意義[19]。由圖1可知，飼喂7 d時，3 組嬰兒配方乳組與基礎日糧組比差異顯著（P＜0.05）；實驗組和市售組II差異顯著（P＜0.05），與市售組I不顯著。隨著喂養(yǎng)時間的延長，實驗組大鼠血清中IL-2的分泌量逐漸增加，在28 d時達到最大，顯著高于其他3 組（P＜0.05）。表明實驗組與市售組相比，最大程度地保留了免疫物質的生物活性，增加了大鼠血清中IL-2的分泌量，改善大鼠免疫功能，增強機體免疫力。

2.2.2 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠IL-4分泌水平的影響

圖 2 嬰兒配方乳對大鼠IL-4分泌水平的影響Fig. 2 Effect of infant formula on the secretion of IL-4 in rats

IL-4主要由活化的T細胞和單核細胞分泌，具有刺激B細胞生長增殖、促進和調節(jié)免疫球蛋白E生成、促進T細胞生長增殖、抑制Th1細胞功能等多種生物學功能，對很多炎癥反應有促進作用[20]。從圖2可以看出，飼養(yǎng)7 d時，實驗組和市售組I與基礎日糧組相比差異顯著 （P＜0.05），而這兩組之間差異不顯著。隨著飼養(yǎng)時間的延長，3 組大鼠血清IL-4質量濃度呈降低趨勢，原因可能是IL-2分泌量的增加抑制了IL-4的分泌。飼喂14 d時4 組差異不顯著；28 d時，市售組I和實驗組與基礎日糧組相比差異顯著（P＜0.05），而這兩組之間差異不顯著，市售組II與實驗組差異顯著（P＜0.05）。結果表明，實驗組有降低大鼠血清中IL-4質量濃度的趨勢，誘導了以Th1細胞為主導的免疫應答。說明實驗組與市售組比能促進免疫細胞對IL的合成和分泌，有效增強大鼠機體免疫力。

2.2.3 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠IFN-γ分泌水平的影響

IFN-γ是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的多功能活性蛋白質[21]，主要通過激活單核吞噬細胞來達到殺滅微生物及腫瘤細胞、激活中性粒細胞、強化自然殺傷細胞對腫瘤細胞的殺傷活性、促進巨噬細胞的吞噬功能、抑制宿主向腫瘤細胞提供重要的營養(yǎng)因子或生長因子，從而造成腫瘤細胞的凋亡[22]。因此，本實驗通過測定大鼠血清中IFN-γ的分泌水平來對比評估巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠免疫功能的影響，結果如圖3所示。

圖 3 嬰兒配方乳對大鼠IFN-γ分泌水平的影響Fig. 3 Effect of infant formula on the secretion of IFN-γ in rats

由圖3可知，在飼喂7 d和14 d時，實驗組和市售組I與基礎日糧組相比差異顯著（P＜0.05），市售組II與基礎日糧組相比差異不顯著；飼喂28 d時，實驗組大鼠IFN-γ質量濃度達到最大，顯著高于其他3 組 （P＜0.05）。隨著飼喂時間的延長，IFN-γ質量濃度逐漸增加，原因可能是由于IL-2分泌量的增加促進了IFN-γ的分泌。同時也有研究證明，IFN-γ是細胞介導免疫反應的一個主要標志，具有廣泛的免疫調節(jié)作用。IFN-γ通過促進抗原特異性使T細胞分化成Th1細胞，進而促進Th1細胞的增殖來增強細胞免疫活性；通過降低Th2細胞活性來發(fā)揮抑制體液免疫應答的作用[23-24]。在本研究中，實驗組有增加大鼠血清中IFN-γ質量濃度的趨勢（P＜0.05），說明與市售組相比，實驗組極大地保留了免疫物質的活性，提高了大鼠的免疫防御功能。且隨著飼喂時間的延長調節(jié)作用更加明顯。

2.2.4 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠TNF-α分泌水平的影響

TNF-α主要由巨噬細胞產生，某些T細胞也可分泌，其主要生物活性為直接殺傷腫瘤細胞，亦可促進B細胞的增殖，在許多重要的活性代謝組織如脂肪組織、肝臟和骨骼肌細胞上均有TNF-α的特異性受體[25]。

圖 4 嬰兒配方乳對大鼠TNF-α分泌水平的影響Fig. 4 Effect of infant formula on the secretion of TNF-α in rats

由圖4可知，實驗初期4 組TNF-α的分泌水平沒有顯著性差異；飼喂14 d和28 d時，3 組嬰兒配方乳組與基礎日糧組相比差異顯著（P＜0.05）。實驗結果說明巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳相比能顯著提高血清中TNF-α的分泌水平，顯著改善大鼠的免疫功能。

綜上所述，細胞因子之間具有相互誘生、相互抑制、相互協(xié)同和相互拮抗作用。研究證明IL-2可誘導Th1細胞增殖，IL-4則可誘導Th2細胞增殖，兩者之間存在一定的相互抑制作用，Th1細胞分泌的IFN-γ可降低IL-4分泌水平[26]，IL-2又能夠激活T細胞亞群分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子，增強Tc細胞、自然殺傷細胞等的殺傷活性，這與本研究結果一致。巴氏殺菌嬰兒配方乳可以使免疫向以Th1細胞為主導的免疫應答偏移[27]。說明巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳相比更大地保留了免疫物質的活性，提高了大鼠的免疫防御功能。且隨著飼喂時間的延長調節(jié)作用更加明顯。

2.3 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠血清溶菌酶分泌水平的影響

血清中的溶菌酶由巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞分泌形成，存在于動物體液及組織中。溶菌酶在機體的修復再生、炎癥過程等調節(jié)中發(fā)揮重要作用，可以從不同角度反映細胞免疫功能和機體抗感染能力[28]。

表 3 嬰兒配方乳對大鼠血清溶菌酶分泌水平的影響Table 3 Effect of infant formula on serum lysozyme secretion in rats

由表3可知，實驗初期，4 組大鼠血清溶菌酶分泌量沒有顯著差異；隨著實驗時間延長，飼喂14 d時，與基礎日糧組相比，3 組嬰兒配方乳組均可以顯著提高大鼠血清中溶菌酶質量濃度；飼喂28 d時，實驗組大鼠血清溶菌酶質量濃度達到最高，且與市售組差異顯著（P＜0.05），說明巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳相比，可以顯著提高大鼠血清中溶菌酶質量濃度，提高機體抗感染的能力，增強機體的非特異性免疫能力，并且隨著時間延長效果增強。

2.4 巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠外周血T細胞亞群的影響

T細胞具有不同的功能亞群。CD3是T細胞表面的主要特征性標志物，根據功能和主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子限制性的不同，可將成熟的T細胞分為CD3＋CD4＋和CD3＋CD8＋兩個細胞亞群[29-30]。CD4是Th細胞和Ti細胞的重要表面標志，為MHC-II類分子的受體，可加強CD4＋T細胞與抗原提呈細胞間的黏附力，使T細胞抗原受體與抗原的結合更加穩(wěn)定。CD8分子主要分布于Tc細胞和Ts細胞，它是MHC-I類分子的受體，能夠加強T細胞抗原受體與提呈細胞抗原的結合，促進細胞磷酸化。通過流式細胞儀檢測，大鼠外周血淋巴細胞亞群的測定結果見表4。

表 4 嬰兒配方乳外周血T細胞亞群的影響Table 4 Effect of infant formula on T cell subsets in peripheral blood

通過對4 組數(shù)據進行方差分析，結果顯示，飼喂28 d時實驗組SD大鼠的CD3＋T淋巴細胞相對含量與對照組和市售組相比差異顯著（P＜0.05），表明巴氏殺菌嬰兒配方乳可提高SD大鼠的CD3＋T淋巴細胞相對含量，可能會使SD大鼠的Ti細胞增多，并對抗原識別、信號轉導以及機體快速抗感染免疫起到輔助作用。實驗組SD大鼠的CD4＋T淋巴細胞相對含量與基礎日糧組比差異顯著 （P＜0.05），表明巴氏殺菌嬰兒配方乳可提高SD大鼠的CD4＋T淋巴細胞相對含量，對機體免疫調節(jié)起一定的輔助作用；而CD8＋T淋巴細胞的相對含量不斷增加，表明巴氏殺菌嬰兒配方乳可能有助于免疫網絡的快速形成，并增強機體細胞免疫作用。T細胞作為細胞免疫重要的調節(jié)成分，具有上調和下調免疫應答的功能，其免疫應答功能的實現(xiàn)是依靠CD4＋、CD8＋T淋巴細胞間的相互作用使機體處于免疫平衡狀態(tài)，所以CD4＋/CD8＋可作為初步評估機體免疫狀態(tài)的指標。根據資料顯示，正常人外周血中CD4＋/CD8＋介于0.60～3.45之間[31]，4 組SD大鼠血液中CD4＋/CD8＋均在正常范圍內，飼喂28 d時，與對照組和市售組相比，實驗組SD大鼠CD4＋/CD8＋差異顯著 （P＜0.05），表明其免疫應答的正調節(jié)占優(yōu)勢[32]。

3 結 論

巴氏殺菌嬰兒配方乳作為一種新型嬰幼配方食品填補了國內市場的空白，本實驗通過動物喂養(yǎng)實驗，以2 款市售常溫嬰兒配方乳為對照，對比評估了巴氏殺菌嬰兒配方乳對大鼠血液免疫因子水平及T細胞亞群的影響。巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳比較能夠顯著提高SD大鼠的體質量，促進大鼠生長發(fā)育。巴氏殺菌嬰兒配方乳能提高大鼠血清中細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α及溶菌酶質量濃度，且顯著高于市售組及基礎日糧組；隨著飼喂時間的延長調節(jié)作用更加顯著。巴氏殺菌嬰兒配方乳上調了SD大鼠外周血中CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴細胞的相對含量以及CD4＋/CD8＋，且CD4＋/CD8＋處于正常范圍。巴氏殺菌嬰兒配方乳與市售常溫嬰兒配方乳比較，能夠促進SD大鼠生長及淋巴細胞的增殖分化，增強體液免疫和細胞免疫功能，并輔助機體免疫調節(jié)。