馬淑華，唐 雪，張 凱，孫勇娟，李穎瑞，幸新干

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品營養(yǎng)與功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫 214122）

高脂飲食（high-fat diet，HFD）是肥胖癥發(fā)展的主要原因之一。而肥胖與代謝綜合征如高血壓、血脂異常、胰島素抵抗以及骨質(zhì)疏松密切相關(guān)。有研究表明，在相同HFD條件下，機(jī)體可能呈現(xiàn)出兩種不同的體質(zhì)量調(diào)節(jié)機(jī)制，傾向于增加體質(zhì)量的個體稱為肥胖易感（obesity prone，OP），能夠抵抗肥胖發(fā)生的個體稱為肥胖抵抗（obesity resistant，OR）。OP和OR兩種表型在體質(zhì)量調(diào)節(jié)、生理信號、蛋白表達(dá)和能量消耗等方面存在差異[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多，或使抗氧化防御系統(tǒng)作用減弱[4]，過量的ROS還可通過破壞脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[5-6]。氧化應(yīng)激在肥胖、糖尿病、高血壓等慢性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[7]。

研究表明，高脂飲食會導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激和ROS水平的增加，降低抗氧化能力，并改變消化系統(tǒng)（包括胃腸道）的氧化/還原狀態(tài)[8]。十二指腸是消化系統(tǒng)最重要的部位，鈣吸收率最高，同時也是鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場所，其中鈣吸收涉及3 個不同的步驟，包括鈣流入胞內(nèi)、被運(yùn)送到基底緣以及鈣通過交換蛋白轉(zhuǎn)移入血液，整個過程屬于主動轉(zhuǎn)運(yùn)[9-10]，依賴線粒體ATP參與供能。因此，HFD誘導(dǎo)的十二指腸氧化還原失衡和線粒體功能異?？赡苡绊懩c鈣吸收相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)功能受損，導(dǎo)致鈣吸收減少。已有研究表明，高脂日糧導(dǎo)致C57BL/6小鼠腸鈣吸收減少，并且伴隨著機(jī)體抗氧能力的降低和ROS的增加[11]。

線粒體是細(xì)胞能量生成、ROS來源及細(xì)胞凋亡的主要場所[12]。ROS過量會導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能異常。線粒體功能障礙與肥胖、中風(fēng)、心血管疾病、骨質(zhì)疏松、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病相關(guān)。目前，線粒體已成為治療疾病的一個新靶點(diǎn)[13-14]。

丁酸是經(jīng)由腸道微生物發(fā)酵膳食纖維得到的短鏈脂肪酸，通常以鈉鹽的形式存在[15]。已有研究證實(shí)，丁酸鈉（sodium butyrate，NaB）可降低體質(zhì)量、改善機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)、增強(qiáng)線粒體功能、改善胰島素敏感性[16-17]。有研究報道丁酸可以改善腸道屏障功能，減輕胃腸道損傷[18-19]；本課題組經(jīng)體外研究亦發(fā)現(xiàn)NaB具有較好的抗氧化保護(hù)功能，但是其對高脂飲食條件下十二指腸氧化應(yīng)激及線粒體能量代謝和鈣吸收是否具有更好的改善作用鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)以不同肥胖表型SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，利用高脂飲食研究NaB干預(yù)對于OP和OR大鼠氧化還原狀態(tài)、線粒體能量代謝和腸鈣吸收的影響，為高脂飲食導(dǎo)致鈣吸收減少和線粒體能量代謝紊亂提供營養(yǎng)學(xué)干預(yù)的參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性SD大鼠（生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002） 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。

NaB（純度＞99%） 美國Sigma公司；組織線粒體分離試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、Cu-Zn抑制SOD檢測試劑盒、BCA法蛋白濃度測定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、鈣離子測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；乙酰CoA、NADH、NAD＋、降鈣素（calcitonin，CT）、鈣化醇（1,25(OH)2VD3）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 廈門慧嘉生物科技有限公司；TRizol提取RNA試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）相關(guān)試劑（Oligdt、dNTPs、RNA酶抑制劑（RNAse Inhibitor）、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液）、Nrf2抗體 美國Thermo Scientific公司；QuantiTect SYBR Green PCR Kits 南京諾唯贊生物科技有限公司；引物由上海睿迪生物科技有限公司合成；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop分光光度計 上海采邑生物科技有限公司；7900HT實(shí)時熒光定量PCR儀 美國ABI 公司；5804R臺式高速冷凍離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀、MultiskanMK3酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司；M5酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；微量移液器 德國Eppendorf公司；MPI-B型化學(xué)發(fā)光檢測儀、AB204-N電子天平、320 pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇分組

70 只4 周齡SPF級雄性SD大鼠飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級別隔離屏障環(huán)境，飼養(yǎng)溫度為（23f 2）℃、相對濕度（50f 10）%，晝夜循環(huán)光照12 h/12 h，自由進(jìn)食相應(yīng)的飼料和飲水，每周稱量并記錄體質(zhì)量和采食量。所有實(shí)驗(yàn)操作均按照江南大學(xué)動物使用和福利協(xié)會要求進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性預(yù)飼養(yǎng)1 周后大鼠隨機(jī)分組：正常組（CON，10 只）飼喂正常飼料（12.7%能量來源于脂肪）；高脂組（HFD，60 只）飼喂高脂飼料（45.0%能量來源于脂肪）。持續(xù)飼喂至第8周，高脂組按體質(zhì)量差異分為肥胖易感組（OP，體質(zhì)量位于上1/3）和肥胖抵抗組（OR，體質(zhì)量位于下1/3）[20]。OP和OR組隨機(jī)分一半大鼠飼喂添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaB[21]的高脂飼料，另外一半繼續(xù)飼喂高脂飼料。第20周末注射水合氯醛麻醉后處死采樣分析。正常日糧和高脂日糧配方見表1。

表 1 正常日糧和高脂日糧配方Table 1 Compositions of normal and high-fat diets

1.3.2 代謝平衡實(shí)驗(yàn)

第19周進(jìn)行代謝平衡實(shí)驗(yàn)，預(yù)試3 d后，每天分別收集每籠大鼠的尿液和糞便，記錄飼料消耗量，測定飼料鈣、糞鈣和尿鈣含量。

1.3.3 組織樣品的采集

大鼠飼喂至20 周，宰殺前禁食12 h，稱體質(zhì)量，麻醉后心臟取血，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，分離血漿與血清。大鼠處死后，冰浴中迅速取出十二指腸，去除附著的黏膜，并在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，濾紙擦干后準(zhǔn)確稱取50～100 mg十二指腸，2 h內(nèi)進(jìn)行線粒體提??；制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%組織勻漿液，取上清液4 ℃、3 500 r/min 離心10 min用于ROS水平、氧化還原指標(biāo)及蛋白質(zhì)含量測定。其余組織液氮速凍后保存于－80 ℃待測。

1.3.4 十二指腸線粒體提取

新鮮十二指腸取出后稱取100 mg于離心管中，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后剪碎，加入1 000 μL線粒體分離緩沖液，冰浴勻漿。將勻漿液600hg、4 ℃離心5 min，小心收集上清液，11 000hg、4 ℃離心10 min，收集沉淀即為線粒體，加入40 μL線粒體存儲液重懸后，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.5 指標(biāo)的測定

1.3.5.1 線粒體膜電位和ATP含量

將提取的線粒體加入線粒體存儲液重懸后，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行線粒體膜電位（以對照組為100%）和ATP含量的測定。

1.3.5.2 線粒體NADH/NAD＋和乙酰CoA含量

采用ELISA法測定十二指腸線粒體NADH/NAD＋和乙酰CoA含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.5.3 ROS水平

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的十二指腸勻漿液，采用Luminol化學(xué)發(fā)光法測定，用Origin 7.0軟件對實(shí)驗(yàn)峰面積進(jìn)行積分，以1 mg蛋白的發(fā)光強(qiáng)度表示ROS水平。線粒體ROS水平以相對于CON組的含量表示。

1.3.5.4 氧化還原指標(biāo)

T-AOC、MDA、SOD、Mn-SOD、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione disulfide，GSSG）、GSH-Px水平測定按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5.5 鈣吸收指標(biāo)

飼料和糞便中鈣含量依據(jù)GB 5009.92ü 2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測定》中方法，經(jīng)HNO3和HClO4（體積比20∶1）消化后測定，尿樣中鈣含量用鈣測定試劑盒測定。鈣凈吸收量和鈣貯留量分別按式（1）、（2）計算。

1.3.5.6 血清CT和1,25(OH)2VD3質(zhì)量濃度

血清CT和1,25(OH)2VD3質(zhì)量濃度采用ELISA試劑盒測定。

1.3.5.7 實(shí)時熒光定量PCR分析

采用TRizol試劑提取十二指腸總RNA。依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時熒光定量PCR使用SYBR Green PCR Kits在7900HT實(shí)時熒光定量PCR儀中進(jìn)行。數(shù)據(jù)通過2－ΔΔCt法進(jìn)行相對定量計算，結(jié)果均為相對于對照組基因的改變量。引物序列如表2所示。

1.3.5.8 組織蛋白Western blot檢測

取出20 mg組織加入200 μL含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，冰浴下充分勻漿。充分裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液測定各組蛋白質(zhì)量濃度并適當(dāng)稀釋至5 μg/μL。采用恒壓80 V進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳30 min左右。設(shè)置每1 cm2電流為1～2 mA進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜，時間1～2 h。轉(zhuǎn)膜后用TBST洗滌3 次，加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉液，將膜置于脫色搖床室溫下?lián)u動封閉2 h，封閉結(jié)束后用TBST洗滌3 次；加入一抗抗體（抗體稀釋體積比為1∶1 000）于4 ℃孵育過夜；過夜后用TBST洗滌3 次；洗滌后將膜置于二抗中室溫?fù)u床搖動孵育2 h，孵育結(jié)束之后用TBST洗滌3 次。用化學(xué)發(fā)光法顯色并成像，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描和拍照，在Image-Pro Plus軟件中分析條帶灰度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 19軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，運(yùn)用單因素方差分析、Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01，高度顯著水平為P＜0.001。用GraphPad Prism 5.01軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaB對高脂日糧誘導(dǎo)不同肥胖表型大鼠體質(zhì)量增加量和采食量的影響

由圖1A可知，第20周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，與CON組相比，OP組大鼠體質(zhì)量增加量顯著增加（P＜0.05）；OR組則與CON組無顯著差異；與OP組相比，OP＋4% NaB組大鼠體質(zhì)量增加量顯著降低（P＜0.05）；與OR組相比，OR＋4% NaB組大鼠體質(zhì)量增加量顯著降低 （P＜0.05）。由圖1B可知，與CON組相比，OP組大鼠采食量升高；與OP組相比，OP＋4% NaB組大鼠采食量降低；與OR組相比，OR＋4% NaB組大鼠采食量略有降低，但各組均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 NaB對高脂日糧誘導(dǎo)不同肥胖表型大鼠十二指腸 氧化還原穩(wěn)態(tài)的影響

表 3 NaB對高脂日糧大鼠十二指腸抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 Effect of NaB on duodenum antioxidant indexes of high-fat diet fed rats

由表3可知，與CON組相比，OP組大鼠十二指腸SOD活力極顯著降低（P＜0.01），GSSH/GSSG顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與OP組相比，OP＋4% NaB組大鼠十二指腸T-AOC極顯著增加（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.05）；與OR組相比，OR＋4% NaB組大鼠十二指腸T-AOC和GSH-Px活力極顯著升高（P＜0.01）。

2.3 NaB對高脂日糧誘導(dǎo)不同肥胖表型大鼠十二指腸抗氧化基因和蛋白表達(dá)水平的影響

圖 2 NaB對OP和OR組大鼠十二指腸抗氧化基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 2 Effect of NaB on the expression of antioxidant-related genes in duodenum of OP and OR rats

由圖2可知，與CON組相比，OP組大鼠十二指腸抗氧化相關(guān)基因Nrf2、HO-1和AMPKmRNA表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.01），NQO-1mRNA表達(dá)顯著下調(diào) （P＜0.05），GSK-3βmRNA表達(dá)極顯著上調(diào)（P＜0.01）；與CON組相比，OR組Nrf2mRNA表達(dá)極顯著下調(diào) （P＜0.01），HO-1、NQO-1和AMPKmRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；與OP組相比，OP＋4% NaB組大鼠十二指腸抗氧化相關(guān)基因Nrf2和NQO-1mRNA表達(dá)極顯著上調(diào)（P＜0.01），GSK-3βmRNA表達(dá)顯著下調(diào) （P＜0.05）；與OR組相比，OR＋4% NaB組大鼠十二指腸抗氧化相關(guān)基因Nrf2mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；其他基因的mRNA表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）。

圖 3 NaB對OP組和OR組大鼠十二指腸Nrf2蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 3 Effect of NaB on the expression of Nrf2 protein in duodenum of OP and OR rats

由圖3可知，與CON組相比，OP組大鼠十二指腸Nrf2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；與OP組相比，OP＋4% NaB組大鼠十二指腸Nrf2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）， 其他各組蛋白表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 NaB對高脂日糧誘導(dǎo)不同肥胖表型大鼠十二指腸線粒體能量代謝和內(nèi)部抗氧化酶活力的影響

圖 4 NaB對OP和OR組大鼠線粒體抗氧化酶活力和能量代謝的影響Fig. 4 Effect of NaB on mitochondrial antioxidant enzyme activities and energy metabolism in OP and OR rats

由圖4可知，與CON組相比，OP組大鼠十二指腸線粒體能量代謝相關(guān)指標(biāo)乙酰CoA含量、NADH/NAD＋極顯著升高（P＜0.0 1），A T P 含量極顯著降低 （P＜0.01），線粒體抗氧化酶相關(guān)指標(biāo)ROS相對含量極顯著升高（P＜0.01），Mn-SOD活力極顯著降低 （P＜0.01），GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05）；與CON組相比，OR組大鼠十二指腸線粒體能量代謝相關(guān)指標(biāo)和線粒體抗氧化酶相關(guān)指標(biāo)無顯著性差異；與OP組相比，OP＋4% NaB組大鼠十二指腸線粒體能量代謝指標(biāo)乙酰CoA含量、NADH/NAD＋極顯著降低 （P＜0.01），ATP含量極顯著升高（P＜0.01），線粒體抗氧化酶相關(guān)指標(biāo)ROS相對含量極顯著降低（P＜0.01），Mn-SOD活力極顯著升高（P＜0.01），GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05）；與OR組相比，OR＋4% NaB組大鼠十二指腸線粒體能量代謝相關(guān)指標(biāo)ATP含量顯著升高 （P＜0.05），其他指標(biāo)無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 NaB干預(yù)對高脂日糧誘導(dǎo)不同肥胖表型大鼠腸鈣吸收的影響

由表4可知，與CON組相比，OP組大鼠鈣平衡實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)糞鈣和尿鈣含量顯著升高（P＜0.05），鈣凈吸收和貯留量極顯著降低（P＜0.01）；與CON組相比，OR組大鼠鈣平衡相關(guān)指標(biāo)無顯著性差異；與OP組相比，OP＋4% NaB組大鼠鈣平衡相關(guān)指標(biāo)尿鈣含量顯著降低（P＜0.05），鈣貯留量顯著升高（P＜0.05）；與OR組相比，OR＋4% NaB組鼠鈣平衡相關(guān)指標(biāo)無顯著性差異（P＞0.05）。

表 4 NaB對高脂日糧大鼠鈣代謝平衡的影響Table 4 Effect of NaB on calcium metabolism balance in high-fat diet fed rats

2.6 NaB干預(yù)對高脂日糧誘導(dǎo)不同肥胖表型大鼠鈣穩(wěn)態(tài)及鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因mRNA表達(dá)水平的影響

圖 5 NaB對OP和OR組大鼠血液鈣穩(wěn)態(tài)指標(biāo)和十二指腸鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 5 Effect of NaB on the expression of blood calcium homeostasisrelated genes and duodenum Ca2+ transport-related genes in OP and OR rats

由圖5可知，與CON組相比，OP組大鼠血液鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)指標(biāo)血鈣濃度、CT質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控激素1,25(OH)2VD3質(zhì)量濃度顯著升高 （P＜0.05），十二指腸鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)指標(biāo)CAT1mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），NCXmRNA相對表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01）；其他各組大鼠血液鈣穩(wěn)態(tài)和十二指腸鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)指標(biāo)均無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

本研究顯示，NaB干預(yù)顯著降低了OP組和OR組大鼠的體質(zhì)量增加量，但采食量沒有顯著性差異，說明NaB可以防止飲食引起的肥胖，此結(jié)果與Matheus[19]和 Gao Zhanguo[21]等的研究結(jié)果一致。機(jī)體在健康狀態(tài)下氧化和抗氧化作用之間保持動態(tài)平衡，正常細(xì)胞代謝產(chǎn)生ROS，其在細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用[22]。當(dāng)機(jī)體遭到攻擊（如癌癥、應(yīng)激、營養(yǎng)過剩或缺失等）時，體內(nèi)產(chǎn)生過量ROS，ROS和抗氧化防御之間的平衡被打破，容易引發(fā)氧化應(yīng)激[23]。氧化應(yīng)激可引起組織氧化損傷，改變胞內(nèi)信號通路，是多種慢性疾病發(fā)生發(fā)展的核心 環(huán)節(jié)[24-26]。機(jī)體抗氧化酶（如SOD、GSH-Px、CAT）和非酶抗氧化物（如GSH和GSSG）共同參與ROS清除和氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持[27]。MDA是體內(nèi)羥自由基等ROS攻擊細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的主要產(chǎn)物之一，上述幾種抗氧化物質(zhì)活力或含量可在一定程度上反映機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)[28-29]。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食下，OP組和OR組大鼠MDA水平顯著上升，SOD活力和GSH/GSSG顯著降低。表明高脂日糧可能促進(jìn)十二指腸脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低抗氧化酶活力，介導(dǎo)組織氧化應(yīng)激。飼喂NaB后，OP組大鼠T-AOC顯著提高，OR組大鼠GSH-Px活力、T-AOC顯著上升，且OP組和OR組大鼠SOD活力和GSH/GSSG均有一定程度提高，MDA、ROS水平基本恢復(fù)正常，表明NaB干預(yù)可調(diào)節(jié)十二指腸氧化還原狀態(tài)穩(wěn)態(tài)，提高組織抗氧化能力，具有抗氧化保護(hù)作用。Xing Xingan等[30]研究也發(fā)現(xiàn)0.3 mmol/L NaB孵育氧化損傷細(xì)胞可顯著提高T-AOC、抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活力和GSH/GSSG，降低MDA含量，與本研究結(jié)果相似。

Nrf2/ARE途徑是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要信號傳導(dǎo)途徑。Nrf2控制幾種抗氧化酶的表達(dá)，如CAT、GSH-Px和SOD[31]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖個體組織中Nrf2/ARE通路關(guān)鍵因子表達(dá)量降低，ROS水平升高，抗氧化應(yīng)激能力減弱，線粒體功能異常[32-33]?？寡趸瘎┨幚硌趸瘬p傷細(xì)胞MC3T3-E1可通過激活PI3K/Akt介導(dǎo)的Nrf2/HO-1途徑來保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[34]。AMPK是一種保守的絲 氨酸/蘇氨酸激酶，是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和代謝應(yīng)激的關(guān)鍵傳感器，包括神經(jīng)變性、炎癥和氧化應(yīng)激等[35]。AMPK介導(dǎo)的GSK-3β失活可以增加Nrf2的核積累[36]。本研究結(jié)果顯示，NaB干預(yù)可顯著上調(diào)OP組和OR組大鼠十二指腸Nrf2、NQO-1、HO-1、AMPKmRNA表達(dá)，下調(diào)GSK-3βmRNA表達(dá)水平。Western blot結(jié)果也顯示NaB顯著上調(diào)OP組大鼠組Nrf2蛋白表達(dá)水平。Gessner等[37]發(fā)現(xiàn)抗氧化劑多酚物質(zhì)可通過提高Nrf2及下游相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)減輕十二指腸炎反應(yīng)；Xing Xingan等[30]發(fā)現(xiàn)，NaB孵育氧化損傷細(xì)胞可顯著上調(diào)Nrf2、NQO-1mRNA表達(dá)水平，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，這與本研究結(jié)果一致。表明NaB可能調(diào)節(jié)十二指腸Nrf2/ARE氧化應(yīng)激信號通路相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)，提高細(xì)胞抗氧化能力，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)。

線粒體是機(jī)體進(jìn)行能量代謝的主要部位，同時也是ROS產(chǎn)生和攻擊的主要靶點(diǎn)，過量ROS極易對線粒體膜、蛋白以及線粒體DNA造成損傷，引起線粒體功能異常，主要表現(xiàn)為線粒體DNA及線粒體內(nèi)含物的減少、氧化磷酸化等能量代謝過程受損、ATP合成減少[38]。NADH和NAD＋的氧化還原狀態(tài)是連接分解代謝途徑、線粒體氧化磷酸化以及產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[39]。乙酰CoA是主要的二碳單位代謝物，可通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。研究表明，魚藤酮處理可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體產(chǎn)生氧化損傷，電子呼吸鏈?zhǔn)艿揭种疲@著增加NADH/NAD＋， 升高乙酰CoA水平[40]。當(dāng)機(jī)體線粒體功能受損時，能量供給不足，NADH過量且NAD＋缺乏，造成線粒體氧化還原狀態(tài)失衡、電子泄漏和氧化應(yīng)激增強(qiáng)，膜電位降低，ROS產(chǎn)生增加，ATP生成異常[41-43]。Mn-SOD和GSH-Px主要存在于線粒體基質(zhì)中，是線粒體內(nèi)重要的抗氧化酶，對清除線粒體ROS、維護(hù)線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)具有重要意義[44]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂NaB可增強(qiáng)OP組和OR組大鼠十二指腸能量代謝ATP生成量，平衡乙酰CoA含量和NADH/NAD＋，降低ROS含量，提高線粒體內(nèi)部抗氧化酶Mn-SOD、GSH-Px活力，其中OP組效果最好，OR組無顯著性影響。已有研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑白藜蘆醇可通過提高AF小鼠Mn-SOD、GSH-Px活力恢復(fù)線粒體能量代謝功能[45]，與本研究結(jié)果基本一致，表明NaB可提高十二指腸線粒體ATP生成和相關(guān)抗氧化酶活力，有效清除過量ROS，進(jìn)而維持線粒體功能，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

鈣占成年人體質(zhì)量的1%～2%。在牙齒和骨骼中有超過全身99%的鈣。膳食鈣攝入量對維持機(jī)體骨骼健康有重要影響。由攝入不足或腸道吸收不良引起的慢性缺鈣是骨量減少的重要原因之一[46]。腸道微生物發(fā)酵產(chǎn) 生短鏈脂肪酸降低腸道pH值，可增加結(jié)腸中鈣的生物利用度[47]。鈣代謝平衡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON組相比，OP組大鼠鈣吸收和貯留量顯著降低，添加4% NaB飼喂OP組大鼠可在一定程度上恢復(fù)腸鈣吸收。此外，高脂飼喂和NaB干預(yù)對OR大鼠均無顯著性影響。表明高脂日糧減少肥胖個體腸鈣吸收，NaB可增加腸道鈣吸收水平。

VDR和CAT1是鈣吸收（跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)）重要基因[48]，為了進(jìn)一步探究NaB干預(yù)對十二指腸鈣吸收和鈣代謝的影響，本研究測定了血鈣濃度、鈣穩(wěn)態(tài)指標(biāo)（1,25(OH)2VD3、CT質(zhì)量濃度）和鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵基因（CAT1、NCX）mRNA表達(dá)水平。已有結(jié)果證實(shí)ROS的產(chǎn)生和去除起到調(diào)節(jié)線粒體功能的重要作用，ROS可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑以及調(diào)控基因表達(dá)[49]。過量的ROS會導(dǎo)致機(jī)體氧化還原狀態(tài)失衡，半胱氨酸殘基-巰基形成二硫鍵[50]。因此，鈣通道會受到ROS或活性氮物質(zhì)的影響[51-52]。研究顯示，ROS調(diào)節(jié)NCX的活性，并受NADH/NAD＋氧化還原電位的影響[53]。本研究結(jié)果證實(shí)CAT1、NCX在OP組大鼠十二指腸中表達(dá)量顯著降低。VD3調(diào)控鈣吸收[54]，本研究結(jié)果顯示高脂飼喂可導(dǎo)致血漿1,25(OH)2VD3質(zhì)量濃度升高，這表明機(jī)體處于缺鈣狀態(tài)，但是腸鈣吸收受到抑制并不是因?yàn)?,25(OH)2VD3的調(diào)控機(jī)制受損。由于十二指腸氧化應(yīng)激導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)和血鈣濃度減少，因此高脂飼喂大鼠可能引起其小腸鈣吸收減少、排出量增加，這與鈣代謝平衡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。通過NaB干預(yù)可在一定程度上恢復(fù)OR大鼠鈣代謝水平并提高OP大鼠鈣凈吸收量和血鈣濃度。由于鈣吸收減少與ROS產(chǎn)生密切相關(guān)，且鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)受機(jī)體線粒體能量代謝和抗氧化狀態(tài)的調(diào)控，推測NaB可通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、維護(hù)線粒體穩(wěn)態(tài)成為預(yù)防肥胖引起鈣吸收減少的重要靶點(diǎn)。

本研究對NaB干預(yù)不同肥胖表型SD大鼠的十二指腸抗氧化保護(hù)作用、線粒體能量代謝和鈣調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高脂飲食可導(dǎo)致十二指腸產(chǎn)生氧化應(yīng)激，線粒體功能受損，血鈣濃度減少，鈣吸收能力減弱，日糧中添加4% NaB可能具有緩解HFD引起的十二指腸線粒體損傷、增強(qiáng)十二指腸抗氧化能力、維護(hù)血液鈣穩(wěn)態(tài)，增加鈣離子吸收量的潛力，且OP大鼠對高脂飲食和NaB干預(yù)敏感性高于OR大鼠。本研究結(jié)果對于肥胖的預(yù)防及肥胖導(dǎo)致鈣吸收減少和線粒體能量代謝紊亂具有重要價值。