姜天依，孫 璐，普秋榕，張亞妮，車會蓮

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

目前，食物過敏性疾病發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)持續(xù)上升[1]。食物過敏是指機體針對攝入的食物產(chǎn)生的一種有害、具有復(fù)發(fā)性的特定免疫反應(yīng)，以免疫球蛋白E（immunoglobulins E，IgE）介導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)為主，即速發(fā)型過敏反應(yīng)，也叫I型超敏反應(yīng)[2]。研究發(fā)現(xiàn)一些具有抗氧化性、抗炎作用的生物活性成分（如黃酮類的多酚物質(zhì)）具有抗過敏功效[3-5]。

甘草是一種被廣泛應(yīng)用的藥食同源植物，甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是甘草中最重要的活性成分之一，又稱甘草甜素[6]。GA是一種五環(huán)三萜系列皂苷[7]， 對動物的免疫功能具有影響作用，可能與其抗炎、抗病毒性相關(guān)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，GA在炎癥相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子的核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路中具有關(guān)聯(lián)[9]。

從患有腫瘤的Wistar大鼠體內(nèi)分離克隆得到的大鼠嗜堿性粒細(xì)胞（rat basophilic leukemia cells，RBL）與黏膜肥大細(xì)胞相似，可以在細(xì)胞表面正常表達(dá)IgE高親和力受體，并可被抗原激發(fā)而發(fā)生脫顆粒釋放導(dǎo)致炎癥[10]。β-氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase，HEX）是脫顆粒的一種生物標(biāo)志物，釋放后不會和組胺一樣很快被分解，其釋放水平通常用作判斷RBL或肥大細(xì)胞的脫顆粒程度[11]。

有研究顯示，激發(fā)過敏反應(yīng)的信號傳導(dǎo)過程與胞內(nèi)鈣離子水平密切相關(guān)，基質(zhì)交互分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）和瞬時受體I型電位通道（transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 1，TRPC1）蛋白對鈣離子釋放、傳導(dǎo)有調(diào) 控作用[12-13]。

目前對GA的抗過敏作用機理尚缺乏深入了解。本研究通過建立小鼠被動皮膚過敏（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）和過敏性皮炎模型來確定GA的抗過敏功效，并在分析GA是否具有降低胞內(nèi)鈣離子水平作用的基礎(chǔ)上，探究鈣離子通道蛋白的表達(dá)水平在GA處理前后的差異，確定GA是否通過影響鈣離子通道蛋白的表達(dá)來影響鈣離子水平。以期為深入探究GA的抗過敏機理及治療過敏反應(yīng)開拓新的方法。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雌性BALB/c小鼠（生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001），4～5 周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，購于維通利華公司。

大鼠RBL白血病細(xì)胞系RBL-2H3購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，來源于美國菌類保藏中心，編號CRL-2256TM，在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B的Eagle’s MEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

牛血清白蛋白、小鼠抗二硝基苯酚IgE單克隆抗體、二硝基苯基化人血清白蛋白（dinitrophenylated human serum albumin，DNP-HSA）、伊文思藍(lán)染液 美國Sigma公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor receptor-α，TNF-α）檢測試劑盒 美國eBioscience 公司；小鼠組胺酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；超純RNA提取試劑 日本TaKaRa 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5804 R型低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；JB5374-91型電子天平 常熟市金羊砝碼儀器有限公司；Varloskan Flash多功能酶標(biāo)儀 美國 Thermo Scientific公司；水浴鍋 德國Peter Huber K?ltemaschinenbau公司。

1.3 方法

1.3.1 雌性BALB/c小鼠PCA實驗

為明確GA的抗過敏功效，本研究建立了雌性BALB/c 小鼠PCA模型，經(jīng)抗原激發(fā)后，檢測血清中的組胺質(zhì)量濃度，并通過向小鼠耳部注射伊文思藍(lán)染液來檢測其血管通透性的改變。

參考Zhou Cui等[14]的方法，將50 只BALB/c小鼠正常飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，按體質(zhì)量隨機分為5 組，每組10 只，分別為陰性對照組、色甘酸鈉組（50 mg/kgmb）、 G A 低 劑 量 組（1 m g/k gmb）、G A 中 劑 量 組 （10 mg/kgmb）、GA高劑量組（100 mg/kgmb）。

第0天給予小鼠右耳注射抗DNP-IgE致敏，之后連續(xù)3 d，各組動物分別灌胃給予生理鹽水、色甘酸鈉以及GA低、中、高3 個劑量處理，每天1 次。最后1 次灌胃后，尾靜脈注射200 μL抗原DNP-HSA與質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%伊文思藍(lán)染液的混合物（體積比1∶1），激發(fā)小鼠的被動過敏反應(yīng)。

抗原激發(fā)20 min后，各組小鼠分別進(jìn)行內(nèi)眥靜脈叢采血，收集于預(yù)先裝有抗凝劑的離心管中。靜置1 h后，經(jīng)2 000hg離心20 min后，吸取上層血清，－80 ℃保存。組胺質(zhì)量濃度采用ELISA試劑盒進(jìn)行測定，具體測定步驟參照試劑盒說明書，組胺質(zhì)量濃度越高，說明肥大細(xì)胞脫顆粒越嚴(yán)重，PCA反應(yīng)越劇烈。抗原刺激后，觀察小鼠耳部顏色變化。采血后處死小鼠，取鼠耳組織勻漿后浸泡于甲酰胺溶液中，利用分光光度計分析浸提液630 nm波長處的吸光度。

1.3.2 雌性BALB/c小鼠過敏性皮炎實驗

為探究GA在治療接觸性過敏性皮炎中發(fā)揮的作用及機理，建立雌性BALB/c小鼠過敏性皮炎模型，并測定小鼠耳腫脹程度和血清中TNF-α質(zhì)量濃度。參考 Wang Jing等[15]的方法，將50 只BALB/c小鼠正常飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，隨機分為5 組，每組10 只，分別為陰性對照組、模型組以及GA低劑量組（1 mg/kgmb）、 G A 中 劑 量 組（1 0 m g/k gmb）、G A 高 劑 量 組（100 mg/kgmb）。

小鼠于實驗前1 d腹部脫毛，范圍約3 cmh 3 cm，實驗第1天脫毛部位均勻涂以體積分?jǐn)?shù)1%二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB）丙酮橄欖油（丙酮、橄欖油體積比4∶1）溶液50 μL進(jìn)行致敏，實驗第2天重復(fù)強化致敏1 次。首次致敏后當(dāng)天開始灌胃GA溶液0.2 mL，陰性對照組和模型組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)5 d。實驗第5天灌胃后，小鼠雙耳各均勻涂1% DNFB丙酮橄欖油溶液10 μL進(jìn)行激發(fā)。陰性對照組在相同部位僅涂以丙酮橄欖油溶液作對照。在激發(fā)前及激發(fā)后24 h，分別用游標(biāo)卡尺測量小鼠雙側(cè)耳中部的厚度，計算激發(fā)前后的耳厚度差，厚度差越大，說明過敏性皮炎反應(yīng)越劇烈。

小鼠摘眼球取血，分離血清置于－20 ℃冰箱中待測。采用ELISA試劑盒測定血清中TNF-α質(zhì)量濃度，TNF-α質(zhì)量濃度越高，說明過敏性皮炎反應(yīng)越劇烈。

1.3.3 HEX釋放水平測定

參考陳晨等[16]的方法，將5h 105個/mL的RBL-2H3細(xì)胞以200 μL/孔接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h。用PBS洗滌后，加入1 μg/mL抗DNP-IgE（100 μL/孔，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋，陰性對照孔不加），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。細(xì)胞給予100 μL/孔不同質(zhì)量濃度（0、100、333、500、1 000 μg/mL）的GA處理20 min后，棄掉上清液，用Tyrode’s緩沖液洗滌2 次，各組依次加入100 ng/mL DNP-HSA（50 μL/孔，Tyrode’s緩沖液稀釋），在37 ℃反應(yīng)45 min，將96 孔板置于冰上冷卻15 min以終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)移30 μL上清液至另一個96 孔板，加入50 μL含1.3 mg/mL 4-硝基苯基-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖的檸檬酸溶液，37 ℃反應(yīng)1 h。加200 μL碳酸鈉緩沖液終止反應(yīng)，測定405 nm波長處的吸光度。全部釋放組用1% Trition X-100代替過敏原處理細(xì)胞，陰性對照組用PBS代替過敏原處理細(xì)胞。結(jié)果以HEX釋放率表示，如式（1）所示計算。

1.3.4 胞內(nèi)鈣離子水平的測定

參考潘雪刁等的方法[17]，將細(xì)胞接種到6 cm的培養(yǎng)皿中，利用1 μg/mL抗DNP-IgE在37 ℃下致敏2 h后，使用D-hank’s緩沖液洗細(xì)胞兩次，之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，再沖洗兩次，以相同密度重懸于1 mL含有2 μmol/L Fluo-3 AM的細(xì)胞染色緩沖液中，37 ℃下避光孵育30 min，沖洗兩次，離心并重懸，將1h 105個/mL細(xì)胞接種到96 孔板中，刺激之前30 s檢測基礎(chǔ)Ca2＋水平，30 s時加入100 ng/mL DNP-HSA刺激，連續(xù)測定5 min，采用全波長掃描儀檢測激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm處的熒光強度。Ca2＋濃度（[Ca2＋]i）的計算如公式（2）所示。

式中：Kd為熒光劑與Ca2＋形成配合物的解離常數(shù)（400 nmol/L）；Fmin是熒光劑沒有結(jié)合Ca2＋時的熒光強度（采用含5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸的D-hank’s緩沖液處理細(xì)胞）；Fmax是熒光劑被Ca2＋飽和時的熒光強度（采用0.1% Triton X-100處理細(xì)胞）；F為樣品的熒光強度。

1.3.5 GA對鈣離子通道蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)申婷婷等[18]的方法，經(jīng)過細(xì)胞致敏、GA孵育、抗原刺激后，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度測定后，進(jìn)行Western blot實驗，將蛋白以20 μg/孔點樣至質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。在80 V恒壓下電轉(zhuǎn)印2 h，將蛋白條帶印跡到硝酸纖維素膜上。采用TBST/質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入1∶4 000兔源TRPC1單克隆抗體或1∶4 000兔源STIM1單克隆抗體孵育過夜后，用TBST洗滌6 次（5 min/次）。加入1∶8 000 HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體孵育1 h，用TBST洗滌8 次（5 min/次）。然后加入HRP-DAB增強顯色液進(jìn)行顯色。蛋白表達(dá)量以相對灰度表示。

1.3.6 GA處理對STIM1、TRPCmRNA水平的影響

經(jīng)過細(xì)胞致敏、GA孵育、抗原刺激后，用超純RNA提取試劑提取組織樣本中總RNA。實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。用RNase free H2O溶解沉淀，并將RNA溶液保存于－80 ℃冰箱中。取5 μL RNA用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測RNA的完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA Eraser對RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。對STIM1、TRPC這兩個基因使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀器進(jìn)行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 18.0軟件對測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用GraphPad Prism 5.01軟件作圖，其中細(xì)胞實驗n＝3、小鼠實驗n＝10；P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA對PCA小鼠耳部毛細(xì)血管通透性的影響

色甘酸鈉具有抗過敏作用，已作為抗過敏藥品用于臨床治療。本研究通過耳部注射抗DNP-IgE建立了PCA小鼠模型，在給予PCA小鼠色甘酸鈉和GA處理之后，再由小鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)。用甲酰胺溶液提取各組小鼠耳部組織中的伊文思藍(lán)并進(jìn)行吸光度分析，結(jié)果如圖1所示，色甘酸鈉組和不同劑量GA組的吸光度都極顯著低于陰性對照組（P＜0.01），而100 mg/kgmbGA組顯著低于色甘酸鈉和1 mg/kgmb和10 mg/kgmbGA組。結(jié)果說明GA能夠降低致敏模型小鼠耳部毛細(xì)血管通透性。

圖 1 GA對PCA小鼠耳部血管通透性的影響Fig. 1 Effect of GA on ear vascular permeability of PCA mice

2.2 GA對PCA小鼠血清組胺質(zhì)量濃度的影響

圖 2 GA對PCA小鼠血清組胺質(zhì)量濃度的影響Fig. 2 Effect of GA on histamine level in serum of PCA mice

鼠尾靜脈注射抗原后，采血測定各組PCA小鼠的組胺質(zhì)量濃度。如圖2所示，色甘酸鈉和GA各劑量組PCA小鼠的組胺水平都極顯著低于陰性對照組 （P＜0.01），且對組胺質(zhì)量濃度的降低效果與GA劑量有正相關(guān)性。在1～100 mg/kgmb范圍內(nèi)，GA劑量與抑制肥大細(xì)胞脫顆粒的作用呈現(xiàn)正相關(guān)性。

2.3 GA對DIAD小鼠耳腫脹度的影響

為評價GA對過敏性腫脹是否有治療、緩解作用，建立了DNFB誘導(dǎo)皮炎（DNFB-induced atopic dermatitis，DIAD）小鼠模型，小鼠耳腫脹度是DIAD小鼠的標(biāo)志癥狀之一。檢測結(jié)果顯示高劑量GA處理的DIAD小鼠耳厚度顯著低于DNFB組小鼠（P＜0.05）（表1）。

表 1 GA對DIAD小鼠耳腫脹度的影響Table 1 Effect of GA on ear swelling of DIAD mice

圖 3 GA對DIAD小鼠血清TNF-α質(zhì)量濃度的影響Fig. 3 Effects of GA on TNF-α level in serum of DIAD mice

過敏原激活肥大細(xì)胞后會產(chǎn)生許多細(xì)胞因子，比如TNF-α，在過敏模型中，TNF-α水平越高表明過敏反應(yīng)越劇烈。對小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度的檢測結(jié)果顯示，GA處理能夠降低DIAD小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度。 如圖3所示，10 mg/kg或更高劑量GA處理組的TNF-α質(zhì)量濃度極顯著低于DNFB組（P＜0.01）。表明GA能夠降低過敏性皮炎小鼠血清的TNF-α質(zhì)量濃度。

2.4 GA對肥大細(xì)胞脫顆粒的抑制作用

圖 4 GA 對RBL-2H3細(xì)胞釋放HEX的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effect of GA on the release of HEX in RBL-2H3 cells

肥大細(xì)胞脫顆粒能引發(fā)機體產(chǎn)生過敏癥狀，HEX釋放率是反映細(xì)胞脫顆粒水平的生物指標(biāo)。實驗結(jié)果顯示，GA處理能顯著抑制RBL-2H3細(xì)胞的HEX釋放。如 圖4所示，500、1 000 μg/mL的GA處理使HEX的釋放率分別下降37.9%和54.8%，說明GA能抑制肥大細(xì)胞脫顆粒。

2.5 GA處理對胞內(nèi)鈣離子水平的影響

GA處理抑制了肥大細(xì)胞脫顆粒，為了探究其作用機制，本研究測定了其對胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。用鈣離子熒光探針Fluo-3 AM分析IgE致敏的RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。結(jié)果顯示，GA能夠抑制抗原誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2＋濃度上升。如圖5所示，500 μg/mL和 1 000 μg/mLGA處理顯著降低了細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度。說明GA可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度影響細(xì)胞的脫顆 粒反應(yīng)。

圖 5 GA處 理對RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2濃度的影響 Fig. 5 Effect of GA on intracellular Ca2＋ level of RBL-2H3 cells

2.6 GA處理對鈣離子通道蛋白表達(dá)水平的影響

已有研究表明STIM1和TRPC1蛋白對鈣離子的釋放和傳導(dǎo)有調(diào)控作用。RBL-2H3細(xì)胞經(jīng)過抗DNP-IgE致敏后再進(jìn)行GA處理，并給予DNP-HSA刺激。對提取的細(xì)胞mRNA進(jìn)行實時熒光PCR分析，結(jié)果表明，GA對STIM1和TRPC1的mRNA轉(zhuǎn)錄有一定的抑制作用（表2）。

表 2 GA對STIM1和TRPC1 mRNA表達(dá)水平的影響Table 2 Effect of GA on mRNA levels of STIM1 and TRPC1

圖 6 GA對STIM1（A）、TRPC1（B）蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 6 Effect of GA on the expression levels of STIM1 (A）and TRPC1 (B) proteins

免疫印跡結(jié)果如圖6所示，500 μg/mL和1 000 μg/mL的GA處理顯著降低了細(xì)胞內(nèi)STIM1和TRPC1蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05）。這證明GA可能通過調(diào)控鈣離子通道蛋白的表達(dá)來影響胞內(nèi)鈣離子濃度，從而抑制細(xì)胞的脫顆粒及介質(zhì)的釋放。在1 000 μg/mLGA處理的細(xì)胞中，TRPC1表達(dá)水平甚至低于未給予抗原刺激的陰性對照組，這進(jìn)一步表明GA對TRPC1表達(dá)有顯著的抑制作用。

3 討 論

組胺在變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘等過敏引起的呼吸道慢性炎癥性疾病的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，具有強烈的疏通血管作用，并能增加毛細(xì)血管和微靜脈的管壁通透性，使血漿漏入組織，導(dǎo)致局部組織水腫[20-21]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，色甘酸鈉的主要作用是穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜、抑制鈣離子內(nèi)流、進(jìn)而抑制抗原激發(fā)后的組胺釋放[22]。

在本研究中，GA處理能夠降低PCA模型小鼠血清中的組胺水平，且10 mg/kgmbGA與50 mg/kgmb色甘酸鈉具有同等的降組胺功效。本研究還顯示10 mg/kg或更高劑量的GA能顯著降低PCA模型小鼠血管通透性和DIAD模型小鼠血清中TNF-α水平。此外，RBL-2H3細(xì)胞研究結(jié)果證明GA可以在安全無毒的劑量下抑制RBL-2H3細(xì)胞釋放HEX，說明GA能夠抑制肥大細(xì)胞脫顆粒引發(fā)的過敏反應(yīng)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實了GA的抗過敏作用。

關(guān)于更進(jìn)一步的作用機理，已有一些研究結(jié)果顯示某些信號通路相關(guān)因子（如NF-κB、MAPK、TLRs、PI3K、Akt、TOR等）與GA的抗過敏作用存在關(guān)聯(lián)性[9,23]。但目前對GA抗過敏作用的機制仍然缺乏全面、深入的了解。

相關(guān)研究表明，脫顆粒過程通常依賴于鈣離子的調(diào)控作用，參與調(diào)控的鈣包括來源于胞內(nèi)庫中釋放的鈣離子，也包括由膜通道進(jìn)入胞內(nèi)的胞外鈣[24]。

TRPC1蛋白是調(diào)控胞內(nèi)庫中鈣離子釋放的關(guān)鍵因子，STIM1蛋白是參與調(diào)控胞外鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)的通道蛋白[13,25]。 本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA水平和蛋白水平上，GA處理對TRPC1蛋白和STIM1蛋白的表達(dá)均有抑制作用。由此可以推測，GA可能通過調(diào)控鈣離子釋放和轉(zhuǎn)運蛋白因子的表達(dá)水平，降低抗原激發(fā)后的胞內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而呈現(xiàn)抑制脫顆粒的抗過敏作用，其機制如圖7所示，其中Orai1是參與鈣調(diào)控的一種膜蛋白。

圖 7 GA調(diào)控鈣離子轉(zhuǎn)運機理Fig. 7 Mechanism of action of GA in regulating calcium ion transport

此外，GA對鈣離子的調(diào)控作用也可能直接或間接地抑制小鼠血清中組胺水平升高、血管通透性增大和血清中TNF-α水平增加等過敏反應(yīng)，這還需要展開更加深入的研究。