（甘肅省煙草公司隴南市公司，隴南 746000）

棕色化是指植物體由本色變?yōu)樽厣蛏詈稚倪^程。在自然界造成植物體棕色或深褐色的因素較多，有棕色化反應、高溫碳化、焦糖化以及高濕條件下微生物參與的腐敗反應等。一般所說的棕色化是指棕色化反應。長期以來許多學者對棕色化反應進行了大量研究，并將成果應用到實踐中，為豐富人類物質生活做出了積極的貢獻。特別是在煙草的加工儲藏、茶葉制作、果蔬的加工儲藏、食品加工等方面具有重要作用。但由于棕色化反應的復雜性，人類對棕色化反應的認識還不全面，因此探尋棕色化反應機理，尋找棕色化反應發(fā)生的核心要素對人類認識棕色化反應規(guī)律，人為定向調控棕色化反應，造福人類具有積極的意義。

1 棕色化反應研究與應用現(xiàn)狀

棕色化反應包括酶促棕色化反應和非酶棕色化反應兩類。酶促棕色化反應必須在多酚氧化酶（PPO）的催化作用下才能進行。而酶是由活細胞產生的、對底物具有高度特異性和高度催化效能的蛋白質或RNA，若酶分子變性或亞基解聚均可導致酶活性喪失。非酶棕色化反應又稱美拉德反應，不需要酶的參與就可發(fā)生。

在果蔬加工儲藏過程中，農產品的酶促褐變不僅影響產品外觀、風味、營養(yǎng)和加工性能，尤其對肉色較淺且容易碰傷的水果和蔬菜影響更為嚴重，造成的經濟損失更大［1，2］。同時酶促褐變也是新鮮蔬菜如萵苣、土豆和果汁顏色變化，營養(yǎng)和口感變劣的主要原因［3］。在煙葉的烘烤過程中酶促褐變不但造成煙葉掛灰、蒸片、黑糟，還使葉片破碎度加大、燃燒力減弱、香氣減少、雜氣增加，外在質量與內在品質下降。在綠茶制作中酶促褐變以及儲藏中的美拉德反應都會造成維生素C、茶多酚、咖啡堿、葉綠素含量下降，色澤、湯色、香氣質變差。棕色化反應也有有利的一面。紅茶是全發(fā)酵茶，PPO可以催化氧化兒茶素類物質形成茶黃素類色素，茶黃素類色素對紅茶色、香、味等品質的形成具有關鍵作用。在制作速溶紅茶時，PPO可增加可溶性物質的含量，提高制作率，減輕紅茶的苦澀味，提高速溶紅茶的風味品質［4，5］。普洱茶和煙葉在儲藏陳化過程中的美拉德反應能夠減少雜氣，使香氣更濃郁［6］。食品加工中的美拉德反應可以使烤制出的面包、烤肉等食品色香味俱佳，使蘋果酒、椰棗、葡萄干更香甜［7］。

1.1 酶促棕色化反應研究與應用現(xiàn)狀

在果蔬儲藏加工、茶葉制作、煙草加工等方面酶促棕色化反應普遍發(fā)生。普遍認為：酶促棕色化反應主要是指綠色植物果實、塊莖、葉片細胞中含有多酚類物質，在細胞組織結構完整時多酚類物質、PPO、氧氣各處于一定的區(qū)隔，不容易接觸，很少發(fā)生酶促棕色化反應，而且在細胞處于生命活動較旺盛狀態(tài)時，多酚類物質既進行氧化作用又進行還原作用，氧化還原反應能夠保持平衡［8］。在煙葉烘烤中，當由變黃階段轉入定色階段，葉組織逐漸死亡，細胞結構開始自溶和解體，細胞膜透性增大，使多酚類物質、氧氣可以自由進出細胞組織，PPO、多酚類物質、氧氣很容易接觸，多酚類物質只能被氧化，很少被還原，使多酚類物質被迅速氧化成醌類，醌聚合與細胞內蛋白質的氨基酸反應產生黑色素沉淀。由于多酚類物質是構成果蔬、煙葉、綠茶中香吃味的重要物質，多酚類物質的含量與其品質和芳香吃味是一致的，因而酶促棕色化反應的發(fā)生會造成果蔬、煙葉、綠茶等經濟作物質量的下降。Johnson等人研究發(fā)現(xiàn)［9］，一旦煙葉顏色完全變褐，多酚類物質含量就會減少85%，煙葉的芳香吃味因此而變差，雜氣加重。在烤煙烘烤過程中煙葉酶促棕色化反應往往發(fā)生于變黃時間過長或定色太晚的情況下，此時除具有良好的氧化條件外，也與糖分消耗過度，使葡萄糖提供氫將醌還原的能力降低有關，導致醌類物質積累、顏色變深。在晾曬煙調制過程中由于溫度較低，煙葉變黃變褐的時間較晚，一般在10～20 d，但其步驟是相同的，在變黃前一般不發(fā)生酶促棕色化反應。

1.1.1 影響酶促棕色化反應發(fā)生的內部因素

影響酶促棕色化反應的內在因子有：植物細胞組織內的多酚含量、細胞組織結構損壞程度、細胞組織的含水量、PPO活性。

（1）植物細胞組織內多酚含量及變化。植物多酚廣泛分布于蔬菜、水果、豆類、谷物類、煙草、茶等植物中，以蘋果、香蕉、馬鈴薯、茄子、蓮藕、咖啡、煙草、茶葉中含量較高。據(jù)王巖等［10］研究，花牛蘋果果皮及果肉中多酚含量分別為11.31、1.63 mg/g，成熟蘋果中的多酚主要為綠原酸、兒茶素以及原花青素等。據(jù)趙霖等［11］研究，江西婺源縣3月份采摘的綠茶中多酚含量達228.22 mg/g。Johnson等［9］研究表明，煙葉中多酚類物質含量一般在1.8%～5.2%，煙葉中的多酚主要為咖啡酸、綠原酸、蕓香苷等。在不同生長期多酚含量也發(fā)生著變化，柿果實在花后35～50 d達到最高水平［12］，隨后逐漸降低，煙葉葉片隨著葉齡的增加而增加，在葉齡70 d時達到峰值［13］。

（2）細胞組織結構損壞程度。在細胞組織結構完整的情況下，蘋果、馬鈴薯、煙草、茶葉等并不發(fā)生棕色化反應，但在細胞組織死亡時，如蘋果、馬鈴薯切片，以及當煙葉變黃后如溫度超過45℃，細胞結構遭到破壞，細胞膜的選擇透性逐漸喪失，膜透性增大，將導致：一是原生質大量外滲；二是氧自由進入細胞組織；三是細胞內各種物質與酶混雜在一起，從而導致酶促棕色化反應發(fā)生［14］。

（3）細胞組織含水量。細胞組織內水分狀況決定著酶促棕色化反應強弱，是酶促棕色化反應能否發(fā)生的必要條件。一般認為［15，16］，煙葉變黃末期，煙葉含水量大于原來含水量的50%，就為酶促棕色化反應的發(fā)生奠定了基礎，含水量小于原來含水量的50%，酶促棕色化反應就很難發(fā)生。對于馬鈴薯、蘋果等含水量較多的塊莖和果實，干燥環(huán)境較濕潤環(huán)境其酶促棕色化反應發(fā)生的強度較弱。

（4）PPO活性。PPO是一類普遍存在于植物葉片、組織中，由核基因編碼，能與銅相結合的金屬蛋白酶［17］。PPO能催化鄰苯酚與氧結合生成鄰苯醌，一般植物幼嫩部分含量高。溫度是影響PPO活性的重要因素。溫度對PPO的活性主要產生兩個方面的影響：在適宜溫度范圍內，隨著溫度的上升，PPO活性上升，但當超過最適溫度后，隨著溫度的上升，PPO活性下降，同時伴隨著PPO濃度下降。即溫度對PPO活性和濃度具有雙重影響。孫榮［18］測定了鮮切蘋果在0、4、20、25℃儲藏條件下PPO活性，結果表明在20℃和25℃儲藏條件下PPO活性最高，在4℃儲藏條件下PPO活性最低。宋金隆等［19］對蘋果、鮮茶葉及馬鈴薯的對比研究表明：蘋果、鮮茶葉及馬鈴薯PPO的最適溫度分別為25、30、30℃。戴亞等［20］研究發(fā)現(xiàn)，PPO在20～50℃范圍內保持著較高的活力，并且其活性均在40℃左右最高，在40℃以下PPO是相當穩(wěn)定的，但當溫度超過55℃時，易迅速鈍化失去活性。雷東鋒等［21］研究認為，35℃時煙草PPO活性最高。韓富根等［22］發(fā)現(xiàn)，當溫度在55℃以上時，PPO活性就會迅速下降，當溫度超過75℃，5～7 s可使PPO鈍化。總之溫度不同，PPO活性強弱不同，果蔬中PPO的最適溫度為常溫，但在煙葉烘烤中認為PPO在溫度45～50℃，相對濕度60%以上時被活化，在溫度55℃，相對濕度60%以下時受到抑制。

1.1.2 影響酶促棕色化反應發(fā)生的外部因素

在正常情況下綠色植物果實、塊莖、葉片等很少發(fā)生酶促棕色化反應。當儲藏時間過長或切開，以及煙葉、綠茶等在烘烤炒制過程中技術操作不當時，將會誘導酶促棕色化反應的發(fā)生。在25℃下，蘋果、馬鈴薯、茄子等切開后30 min即發(fā)生棕色化變褐。有研究發(fā)現(xiàn)，在烘烤環(huán)境溫度低于44℃時煙葉變褐速度極為緩慢，當升高到57℃時，僅6 min棕色化反應過程就可全部完成［9］。綠茶在炒制中首先要殺青，要求殺青時葉溫達到80℃以上，目的是將PPO高溫鈍化，防止炒制過程中的變褐，而普洱茶殺青時葉溫不超過65℃，只是鈍化了部分活性酶，接下來的揉捻、曬青過程會發(fā)生酶促氧化和發(fā)酵反應［23］。誘導植物細胞組織酶促棕色化反應的外部因素有兩個：一是環(huán)境溫度，二是環(huán)境相對濕度。兩者結合影響植物細胞組織含水量和PPO活性，從而促進或制約酶促棕色化反應的發(fā)生。一般認為；當煙葉變黃后，如溫度超過44℃、相對濕度60%以上、煙葉失水量少于50%三個條件同時具備時將導致酶促棕色化反應的發(fā)生［16］。

1.1.3 對酶促棕色化反應的調控

調控酶促棕色化反應發(fā)生主要有六個途徑。一是調控多酚類物質的含量。通過品種選育、合理的農業(yè)栽培措施等，可以降低多酚類物質的含量。二是降低PPO的活性。如溫度調控，果蔬儲藏過程中的溫度設定在4℃、綠茶炒制中的高溫殺青使PPO鈍化，以及高壓、輻射和超聲處理等破壞酶促反應賴以發(fā)生的生理生化環(huán)境，從而降低PPO活性。三是酸處理。韓富根［22］通過試驗表明，酶促褐變最適宜的pH范圍在4～7之間，降低或提高介質中的pH，可以控制PPO的活性，抑制其催化作用。四是酶抑制劑。李尼杭等研究指出，煙葉烤前用抑制劑處理能使多酚含量達到人們所要求的范圍。五是驅氧，造成缺氧環(huán)境。在果蔬的儲藏運輸中充入二氧化碳可以抑制酶促褐變；在煙葉烘烤中降低房內氧氣濃度可有效減少棕色化反應的發(fā)生。Watkins等［24］研究指出，煙葉烘烤過程中，當氧氣濃度在0.01%時，酶促褐變基本上不會發(fā)生；當氧氣濃度高于0.5%時，隨著氧氣濃度的增加，煙葉褐變程度逐漸加重。六是減少與金屬物接觸（鐵、銅）。鐵、銅等是PPO激活劑，能促進褐變主要是因為鐵和銅能夠和酚類化合物反應形成褐色物質，還能催化還原酮類的氧化，這是用鐵刀切的蘋果、茄子易變褐的原因。在煙葉烘烤上普遍認可的調控酶促棕色化反應的方法是；煙葉基本變黃后，在溫度45℃以前，失水超過50%，進入定色階段后，緩慢升溫，加快排濕，達到煙葉小卷筒，定色階段保持60%以下的相對濕度可以防止煙葉氧化變褐［14］。

1.2 美拉德化反應研究與應用現(xiàn)狀

美拉德反應是指氨基酸與糖類之間的縮合反應。它不需要酶的參與就可發(fā)生，是面包、煙葉、茶葉香氣成分形成的重要過程。在煙葉陳化過程中，美拉德反應形成的阿馬杜里化合物占干重的2%～3%，一般認為這些產物可以賦予煙葉特有的香氣。普遍認為美拉德反應是氨基酸與還原糖的羰基縮合，形成氨基糖經阿馬杜里和海茵氏重排得到中間物，產生糖醛類和還原酮類或脫氧還原醛類，并經環(huán)化或裂解成各種香氣物質。影響美拉德反應的因素：一是pH值，pH值在7～11之間有利于美拉德反應的發(fā)生；二是溫度，溫度越高反應越快，低于80℃時反應不明顯，當高于100℃時反應加快；三是糖，隨著糖濃度的增加反應速度加快；四是金屬離子，二價鐵離子和二價銅離子存在的情況下，褐變速度加快；五是水分，水分在10%～15%時最易發(fā)生褐變；六是氧氣，氧氣充分時易發(fā)生褐變。美拉德反應在生產生活中非常普遍。人類利用美拉德反應實例很多，如烤面包、烤肉、熏魚、紅酒釀制等，在紅燒肉制作過程中肉中的還原糖和氨基酸、肽、蛋白質發(fā)生美拉德反應形成風味物質，生成具有肉香味的化合物，色香味俱佳。在烤煙的復烤、晾曬煙的晾制、發(fā)酵及陳化、卷煙的烘焙、卷煙的燃吸以及普洱茶儲藏陳化中美拉德反應能夠減少雜氣，使香氣更濃郁。

2 棕色化反應認識上存在的問題

經過長期研究，人們對棕色化反應機理取得了一定認識，但仍然不夠深入，特別是對酶促棕色化反應的認識存在許多問題。一是對PPO活性溫度認識有差距。如蘋果在25℃條件下PPO活性最高，在4℃儲藏條件下PPO活性最低，鮮茶葉、馬鈴薯PPO最適溫度為30℃。在煙草上，戴亞等［20］認為40℃左右PPO活性最高，而雷東鋒等［21］等認為35℃時PPO活性最高，但在此溫度范圍內一般并不發(fā)生棕色化反應。韓富根等［22］認為，當溫度在55℃以上時，PPO就會迅速鈍化失去活性。而有人認為，當溫度升高到57℃時，僅6 min棕色化反應過程就可全部完成［9］。經典教科書中認為煙葉烘烤中PPO在溫度45～50℃時被活化。但在葉片受傷以及晾曬煙晾制過程中，常溫下也發(fā)生褐變。二是對酶的氧化性研究較多，而忽視了酶的還原性［25］。三是細胞組織的死亡溫度。傳統(tǒng)認為植物細胞組織致死環(huán)境溫度為50～52℃，超過此溫度，細胞趨于死亡，但生長的植物超過此溫度時細胞組織并不死亡。在煙葉烘烤上操作不當時，在50～52℃前褐變已經發(fā)生［25］。四是忽視了能量代謝的作用。酶促棕色化是一個可逆過程，還原反應需要吸收能量，能量變化與酚還原成醌的相關性如何？五是在酶促棕色化反應的調控上，很多方法實施難度大、成本高、甚至造成新的傷害。六是對發(fā)生煙草酶促棕色化反應的條件以烤房內溫度、相對濕度等外部條件為主，沒有揭示出煙草酶促棕色化反應的核心要素。七是酶促棕色化反應發(fā)生條件的結論具有片面性，不同研究結論之間關聯(lián)性不高，甚至相互矛盾。如在煙草上認為44℃以下不發(fā)生酶促棕色化反應等。八是對PPO的認識不全面。認為PPO的作用是催化酶促棕色化反應，沒有認識到PPO首先是呼吸酶，其在細胞組織呼吸中的作用。九是對PPO同工酶的種類及不同時期、不同條件下的協(xié)同作用研究少。十是當多酚含量達到峰值后多酚類物質的降解機理研究較少。十一是我國經典教科書中棕色化反應化學式［8］不正確，鄰苯醌的苯環(huán)上碳原子和氧原子共價鍵不符合基本科學原理（圖1）。

圖1 經典教科書中酶促棕色化反應化學式

3 棕色化反應理論的再認識

植物多酚是多羥基酚類化合物的總稱，其廣泛分布于蔬菜、水果、谷物、煙草、茶等植物中。它在植物體的葉、木、皮、殼和果肉中均有一定含量［26］。人類最早認識多酚是由于其能與蛋白質結合或與消化道內的酶結合降低蛋白質的消化性，影響營養(yǎng)成分的吸收，引起便秘等消化不良癥狀，以及造成果蔬褐變變質等不利因素。隨著研究的不斷深入，人類認識到多酚是植物體內的重要代謝產物，具有抗氧化、抗衰老、抗紫外線、保濕等作用，對多種細菌、真菌、酵母菌都有明顯的抑制作用，對增強植物抗性具有積極的作用［27］。在綠色植物生長過程中如遇病蟲害侵染、惡劣環(huán)境、機械損傷等不利因素時植物通過棕色化反應造成局部壞死，以惡化病蟲害侵染環(huán)境，在受傷部位形成保護層。在種子成熟前核桃、蘋果、柿子、梨等果實的外皮含有大量的酚類使果實吃起來苦澀難咽，確保了種子成熟，而在果實成熟后酚類降解或轉化成為香氣物質，使果實香甜、色澤艷麗，以吸引動物將種子擴散、生命得到延續(xù)［28］。而美拉德反應會賦予食品誘人的色澤及特殊的風味，給人類帶來視覺、味覺及嗅覺的享受。一般在果蔬儲藏運輸中發(fā)生的棕色化反應為酶促棕色化反應，食品加工中發(fā)生的棕色化反應為美拉德反應，而煙草的加工儲藏、茶葉制作儲藏中既有酶促棕色化反應，又有美拉德反應。

3.1 棕色化反應機理探究

雖然在發(fā)生酶促棕色化反應植物組織細胞內都含有多酚類物質、PPO、氧氣，但植物生長及衰老過程中一般并不發(fā)生棕色化反應，這主要是由PPO的性質和多酚類物質、PPO、氧氣所處位置決定的。首先，PPO是一種呼吸氧化酶，與細胞色素氧化酶、黃酶等共同參與細胞組織的呼吸作用。PPO對氧的親和力較弱，其在高氧條件下效率較高。因而PPO在生長過程也參加呼吸氧化反應，只是強度弱，是多酚物質在組織體內降解的途徑之一，也是多酚物質含量在達到峰值后其含量下降但沒有變褐的原因。而且PPO不具有還原性、不可能將鄰苯醌還原成鄰苯酚。其次，在生長和衰老過程中細胞組織結構完整，多酚類物質、PPO、氧氣各處于一定的區(qū)隔，不容易接觸。三者相互接觸是酶促棕色化反應發(fā)生的關鍵。只有細胞組織結構解體才能讓三者相互接觸。細胞組織結構解體的途徑有兩種：一是細胞組織結構的損傷，如植物組織受病蟲害侵染、機械損傷、凍害或高溫傷害；二是細胞組織衰老后的程序性死亡。在自然界由于組織結構的損傷而發(fā)生酶促棕色化反應的現(xiàn)象很多，如赤星病病斑、斑須蝽刺吸口器造成的黑斑、馬鈴薯切塊后變褐、葉片傷口變褐、果蔬受凍害后變褐、葉片凍害后形成的水煮葉、葉片高溫傷害形成的蒸片等。當細胞組織衰老后細胞組織的抗逆力下降，如細胞組織溫度升高，細胞膜及類囊體膜上的蛋白質變性失活，或隨著細胞組織的程序化死亡，膜透性增大，膜的選擇透性逐漸喪失，組織結構解體，酶促棕色化反應隨之發(fā)生。在衰老死亡方面，馬鈴薯、香蕉由于存放時間過長會引發(fā)褐變。在烤煙烘烤中葉片變黃后，濕煙葉組織溫度超過38℃［25］（變黃后濕煙葉組織細胞致死溫度為38℃），如葉片失水率不超過50%，會導致酶促棕色化反應發(fā)生。但在烤煙、晾曬煙變黃后，如葉片失水率不超過50%，即使?jié)駸熑~組織溫度不超過38℃，但隨著細胞組織的程序化死亡也伴隨細胞組織結構的解體，葉片變褐。因此細胞組織結構的解體是發(fā)生酶促棕色化反應的充要條件（圖2）。

圖2 酶促棕色化反應化學式

美拉德反應是氨基酸與糖的縮合反應，在自然界普遍發(fā)生，如烤煙的復烤、陳化、晾曬煙的晾制以及普洱茶儲藏陳化、食品的烤制都是美拉德反應。高溫高濕能加快美拉德反應的發(fā)生，如烤制面包、烤肉時發(fā)生美拉德反應只需幾十分鐘，在煙葉的復烤、煙絲烘焙中需采用高溫高濕，而卷煙吸燃過程的美拉德反應則用微秒計算。晾曬煙變黃后在凋萎過程中發(fā)生輕微的變褐現(xiàn)象，其主要變褐發(fā)生在煙葉凋萎后，在凋萎過程中發(fā)生的變褐主要是酶促棕色化反應，而在凋萎后發(fā)生的變褐主要是美拉德反應，由于晾曬過程中溫度較低反應慢，所以晾曬過程比烘烤過程更耗時。對于煙葉的自然陳化，低溫干燥的西北地區(qū)比溫濕度高的江南地區(qū)要慢。普洱茶老葉帶梗需陳化更長時間。

3.2 棕色化反應的調控

在生產生活中要阻止酶促棕色化反應就必須防止細胞組織結構的解體。首先要減少細胞組織結構的損傷，如及時防治植物生長過程中病蟲害的發(fā)生、減少人畜對植物的機械損傷、防止早春和晚秋的凍害、減少果蔬加工儲藏運輸中的破損及溫度過低造成的凍害。在煙葉、綠茶的采摘調制過程中減少機械損傷、在堆放過程中避免高溫、烤房內裝煙要均勻避免局部過密出現(xiàn)高溫等。其次要降低細胞組織衰老死亡的速度，如在低溫（4℃）或低氧條件下儲藏運輸果蔬，可降低其代謝水平，延緩衰老死亡的速度，并在其衰老死亡前將果蔬出庫銷售。對于需長期儲藏的荔枝等多汁水果就必須將溫度降到0℃以下并配合200 kPa左右的氣壓，如果在常壓下儲藏溫度低于0℃，隨著體內水結冰體積增大會破壞細胞結構，只有在高壓下體積不變并形成均勻的冰晶，才不會損傷細胞組織結構。當細胞組織結構的解體不可避免時，可以通過改變環(huán)境阻止酶促棕色化反應的發(fā)生。如切塊的蘋果、馬鈴薯可以放置在水中（隔氧）或用水漂洗（多酚、PPO溶入水中）可以降低酶促棕色化反應的發(fā)生。在煙葉烘烤中當煙葉變黃后快速失水讓煙葉達到充分凋萎，在主脈發(fā)軟（失水30%）前組織溫度不超過37℃，在定色期煙葉小卷筒（失水50%）前煙葉組織溫度不超過38℃，就是要在煙葉衰老變黃后細胞組織解體前通過失水的方式將原生質變?yōu)槟z，PPO失去活性，同時終止細胞組織的程序化死亡，否則就可能發(fā)生酶促棕色化反應，煙葉變褐，質量下降。在綠茶的制作中通過高溫殺青在細胞組織解體前鈍化PPO活性，以阻止炒制過程中酶促棕色化反應，如高溫殺青不徹底，炒制出的綠茶顏色就會發(fā)暗，品質下降。在美拉德反應方面，人類通過高溫或高濕加快美拉德反應的速度，如烤肉、烤饃等，而且通過在紅燒肉中加糖、在面包表面抹一層蛋液等方式增加美拉德反應的強度，使制作出的食品色香味俱佳，在晾曬煙晾制過程中通過增加濕度來增加晾曬煙的香氣與色度。將綠茶存放在溫濕度低的冷藏柜中以阻止美拉德反應，綠茶品質會得到有效的保存，而普洱茶放在干燥、無光、通風處即可。

4 展望

由于棕色化反應的復雜性，棕色化反應機理以及反應過程的中間產物等許多問題尚不清楚。如植物在衰老過程中多酚的降解產物等。隨著現(xiàn)代生物技術的進步，必將對棕色化反應分子生物學的發(fā)展帶來新的契機。而且通過轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學研究，將會對棕色化反應分子機理的認識進一步深入，最終揭開棕色化反應的神秘面紗。