陳旅翼,黃利豪,蘭洲,劉鵬,梅之南

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院， 武漢 430074;2湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 武漢 430065)

大麻藥(Radix Dolichosae)為豆科植物鐮扁豆(DolichosappendiculatusHand.-Mazz)的干燥根.鐮扁豆別名麻三段、大九莢、鐮葉山扁豆等,主要分布于云南、四川、甘肅、廣東等地，尤以云南為多.本品性辛、麻、溫，有小毒[1,2]，歸肺、心經(jīng).具有“通氣活絡(luò)，活血止血，消腫止痛，接骨生肌”的功效[3].現(xiàn)代研究還發(fā)現(xiàn)大麻藥具有利尿、抗痛風(fēng)、抗腫瘤、抗癌等功效[4-7]，其主要化學(xué)成分為三萜皂苷、生物堿、黃酮等[8-13].

痛風(fēng)是嘌呤代謝紊亂引起的一種代謝性疾病。近年來，隨著生活習(xí)性與飲食結(jié)構(gòu)的改變，痛風(fēng)的發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì).目前痛風(fēng)的治療還局限于緩解急性期的疼痛，和降低血尿酸濃度.而臨床所用一線藥多具不良反應(yīng)[14],前期研究發(fā)現(xiàn)大麻藥總皂苷在抗痛風(fēng)和治療心血管系統(tǒng)等疾病方面發(fā)揮重要功效，且含量較高.本實(shí)驗(yàn)旨在探究大麻藥總皂苷提取的最佳工藝[15，16]，為工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù).

1 儀器與材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、恒溫水浴鍋(上海亞榮)；循環(huán)水式多用真空泵(上海貝茵)； DHG-9030A鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒)；UPH-I-10T實(shí)驗(yàn)室超純水制造系統(tǒng)(成都優(yōu)普)；電子天平(奧豪斯儀器)；紫外分光光度計(jì)(UV -1800PC， Mapada).

大麻藥經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院陳旅翼副教授鑒定為豆科植物鐮扁豆(DolichosappendiculatusHand.-Mazz)的根(批次：云南昆明20170801).大麻藥粉碎，過4號(hào)篩，粉末備用.大麻藥苷B對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥98.0%)；無水乙醇、分析純乙酸、高氯酸、乙酸乙酯均購自國藥集團(tuán)；香草醛(AR,aladdin,批號(hào)：43885)

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷含量測(cè)定方法學(xué)

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

大麻藥苷B對(duì)照品(面積歸一法≥98.0%，如圖1所示)5.5 mg放于5 mL容量瓶，甲醇定容，超聲溶解，放冷，補(bǔ)足重量.配制成1.1 mg/mL的對(duì)照品溶液.

圖1 大麻藥苷B對(duì)照品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of doliroside B

2.1.2 供試品溶液的制備

大麻藥藥材粉末50.0 g，加10倍量90%乙醇，浸漬1 h，88 ℃下乙醇回流提取2次，每次2 h，將濾渣及濾器洗滌，合并提取液，定容至1000 mL.

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品溶液分別置15 mL具塞試管中，揮干，放冷，加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，在70 ℃水浴中加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出，加入乙酸乙酯適量，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，最終確定在562 nm處有最大吸收，結(jié)果如圖2所示.

圖2 大麻藥苷B對(duì)照品最大吸收波長(zhǎng)掃描圖Fig.2 Scanning chart of doliroside B reference

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按2.1.3方法在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3).結(jié)果表明，質(zhì)量濃度在13.75～68.75 mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好.回歸直線方程為A=19.964C-0.0595,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9989.

圖3 大麻藥苷B標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 standard curve of doliroside B

2.1.5 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性考察

取對(duì)照品溶液0.2 mL，按2.1.3方法測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，以吸光度(A)計(jì)算，結(jié)果表明，RSD為0(表1).這表明儀器精密度良好.

表1 精密度試驗(yàn)
Tab.1 Precision test

序號(hào)吸光度平均值RSD/%10.47820.47830.4780.478040.47850.47860.478

取同一供試品溶液0.05 mL，置15 mL具塞試管，分別于制備后0、15、30、45、60、90、120 min按2.1.3方法測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示RSD為0.62%，表明該方法在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(表2).

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab.2 Stability test

取同一批藥材6份，照上述方法制備供試品溶液，取0.05 mL按2.1.3方法測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示RSD為1.74%，表明方法重復(fù)性良好(表3).

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Tab.3 Replicate test

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)

已知含量的供試品溶液6份，加入對(duì)照品溶液(1.1 mg/mL)0.1 mL, 按2.13方法測(cè)定吸光度，計(jì)算得平均回收率為100.77%.RSD為0.68%(表4)，顯示該方法回收率良好，結(jié)果準(zhǔn)確可信.

表4 大麻藥總皂苷加樣回收率
Tab.4 Recovery test for determination of total saponins from Radix Dolichosae

序號(hào)樣品中總皂苷含量/mg加入對(duì)照品量/mg吸光度回收率/%平均值/%RSD/%10.097980.11000.638101.5020.100080.11000.63999.8530.097080.11000.632100.68100.770.6840.097680.11000.635100.9550.096480.11000.628100.1360.095580.11000.630101.49

2.2 藥材中總皂苷含量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備

大麻藥粉末3份，每份2.0 g，分別至150 mL具塞錐形瓶中，加70%乙醇50 mL，超聲處理(25 ℃，功率200 W，頻率42 Hz)45 min，過濾，濾液置100 mL容量瓶中，用適量70%乙醇分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻.

2.2.2 供試品溶液含量測(cè)定

取0.05 mL供試品溶液，按2.1.3方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總皂苷含量.取10 mL供試品溶液，用差減法測(cè)定超聲提取物含量.結(jié)果測(cè)得大麻藥總皂苷得率為12.31%，純度為79.54%，結(jié)果見表5.

表5 大麻藥總皂苷含量Tab.5 Content of total saponins of Radix Dolichosae

2.3 大麻藥總皂苷提取單因素考察

2.3.1 乙醇濃度的影響

稱取大麻藥粉末50.0 g，分別加入濃度為70%、80%、85%、90%、95%的8倍量乙醇(以藥材質(zhì)量計(jì))，浸漬1 h,88 ℃下回流提取2 h，連續(xù)2次，合并濾液.取0.03 mL于15 mL具刻度試管，揮干，按2.1方法測(cè)定，計(jì)算大麻藥總皂苷提取率和純度.結(jié)果如圖4所示.分析可知70%、80%乙醇濃度下大麻藥總皂苷提取率較高，但70%、80%乙醇提取下所得提取物濃縮困難，難以形成浸膏，對(duì)后續(xù)除雜、干燥產(chǎn)生較大影響，不利于工業(yè)生產(chǎn)。

圖4 乙醇濃度對(duì)大麻藥總皂苷提取率和純度的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction rate and purity of total saponins

對(duì)比90%和95%乙醇提取率和純度，將提取率和純度兩個(gè)考察指標(biāo)各賦50%，得到90%乙醇濃度下為71.11%，95%為70.52%.故選擇產(chǎn)品便于處理且提取率和純度相對(duì)較高的90%乙醇濃度.

2.3.2 料液比的影響

稱取大麻藥50.0 g，分別加入6、8、10、12倍量(以藥材質(zhì)量計(jì))的90%乙醇.按上述方法處理后，測(cè)定吸光度并計(jì)算大麻藥總皂苷提取率和純度.結(jié)果如圖5所示.據(jù)圖同樣對(duì)料液比1∶8和1∶10各賦50%，綜合得到8倍量時(shí)為72.34%，10倍量時(shí)為70.98%，故選擇料液比1∶8進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖5 不同料液比對(duì)大麻藥總皂苷提取率和純度的影響Fig.5 Effect of different ratio of solid to liquid on extraction rate and purity of total saponins

2.3.3 提取時(shí)間的影響

大麻藥粉末50.0 g，乙醇濃度90%，料液比1∶8,提取2次，浸漬1 h,88 ℃下分別回流提取1、2、3、4 h.取0.03 mL提取液按2.1方法測(cè)定并計(jì)算大麻藥總皂苷提取率和純度.從圖6可看出大麻藥總皂苷得率和提取率在提取2 h時(shí)最高.因此選擇提取時(shí)間為2 h.

圖6 提取時(shí)間對(duì)大麻藥總皂苷提取率和純度的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction rate and purity of total saponins

2.3.4 提取次數(shù)的影響

取大麻藥粉末50.0 g，加入8倍量90%乙醇，浸提1 h,88 ℃下分別回流提取1～4次，每次2 h.取提取液適量測(cè)定并計(jì)算大麻藥總皂苷提取率和純度.結(jié)果發(fā)現(xiàn)2次提取后提取率和純度增加幅度較大，而2次與3次提取增幅較小(圖7). 考慮工業(yè)成本，選擇提取2次更符合實(shí)際.

圖7 提取次數(shù)對(duì)大麻藥總皂苷提取率和純度的影響Fig.7 Effect of extraction times on extraction rate and purity of total saponins

2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.4.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上以大麻藥總皂苷提取率和純度為評(píng)價(jià)指標(biāo)設(shè)計(jì)L9(34)正交表，對(duì)乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)進(jìn)行考察，并下設(shè)3個(gè)較優(yōu)水平(表6).

表6 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.6 Orthogonal test factors and levels

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

大麻藥總皂苷提取率及純度正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7.方差分析提取率結(jié)果見表8，總皂苷提取純度結(jié)果見表9.

由表7極差分析結(jié)果看出，提取次數(shù)對(duì)大麻藥總皂苷提取得率影響較大，4個(gè)因素影響順序?yàn)樘崛〈螖?shù)>乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間，以提取率為考察指標(biāo)最佳工藝為90%乙醇、料液比1∶10、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)2次.以大麻藥提取的總皂苷純度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，4個(gè)因素對(duì)其影響順序?yàn)橐掖紳舛?提取次數(shù)>提取時(shí)間>料液比，最佳工藝為95%乙醇、料液比1∶10、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)2次.將提取率和提取純度兩個(gè)考察指標(biāo)綜合考慮，各賦50%，得出90%乙醇濃度下評(píng)價(jià)值為76.905%，95%乙醇濃度下為76.685%，綜上結(jié)果最終確立大麻藥總皂苷提取的最佳工藝為90%乙醇、料液比1∶10、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)2次.

從方差結(jié)果分析，提取次數(shù)的改變對(duì)總皂苷提取率影響較大，其他因素水平的改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有一定影響.相對(duì)提取純度，則乙醇濃度的改變對(duì)結(jié)果影響較大.綜合考慮極差分析和方差分析，優(yōu)選出大麻藥總皂苷提取工藝為 90%乙醇、料液比1∶10、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)2次.

表7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析

表8 提取率的方差分析Tab.8 Analysis of variance with extraction rate

注：F0.10(2,2)=9.00,F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

表9 提取純度的方差分析
Tab.9 Analysis of variance with extraction purity

因素偏差平方和自由度均方F值顯著性乙醇濃度1409.3952704.69732.133**料液比181.724290.8624.143提取時(shí)間172.717286.3583.938提取次數(shù)362.6742181.3378.269誤差394.7461821.930

注：F0.10(2,2)=9.00,F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

2.4.3工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取藥材50.0 g,共3份，粉碎，過4號(hào)篩，按優(yōu)選出的工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)定大麻藥總皂苷提取率及純度.所得結(jié)果見表10，大麻藥總皂苷平均綜合值為77.475%.表明該工藝穩(wěn)定，可行性且重復(fù)性好.

表10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.10 Results of validation test

3 結(jié)語

通過以上單因素考察和正交優(yōu)化，基本確立了大麻藥總皂苷提取的最佳工藝為90%乙醇濃度、料液比1∶10、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)2次.該工藝重復(fù)性和穩(wěn)定性好，所得提取率及純度較高，總皂苷提取率高達(dá)80%左右，提取純度達(dá)70%以上.后續(xù)將在此工藝的基礎(chǔ)上繼續(xù)開展中試放大研究，從而對(duì)該工藝的工業(yè)化生產(chǎn)的可行性進(jìn)行驗(yàn)證，以期達(dá)到操作簡(jiǎn)單、成本低廉、條件穩(wěn)定、產(chǎn)率及純度較高的預(yù)期.