徐瑞,劉釗，付千，段歡，鄧旭坤*

(1睢寧縣人民醫(yī)院 藥劑科, 徐州221200 ; 2 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院, 武漢430074;3中南民族大學(xué) 學(xué)報(bào)編輯部, 武漢430074)

竹節(jié)參為五加科植物竹節(jié)參(PanarjaponicasC.A. Mey.)的干燥根莖[1].又名竹節(jié)三七、竹節(jié)人參、白三七，主要分布于長(zhǎng)江以南，西起云南西部，東至日本，且存在狹葉竹節(jié)參、珠子參等變種[2,3].竹節(jié)參性溫, 味甘、微苦, 歸 肝、脾、肺經(jīng), 具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、散瘀止痛、止血、祛痰等功效[3].常用于肺癆咳血、跌撲損傷、咳嗽痰多、病后虛弱、虛勞咳嗽、咯血、倒經(jīng)、崩漏、淤血閉經(jīng)、跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛[4].

對(duì)乙酰氨基酚(N-acetyl-para-aminophenol，APAP)，又名撲熱息痛，是臨床上常用的一種解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥[5]，同時(shí)也是最常見的可以引起肝毒性的藥物[6]，對(duì)降低或緩解APAP誘導(dǎo)的肝損傷的研究一直是個(gè)熱點(diǎn)課題.竹節(jié)參自古以來作為少數(shù)民族藥材使用至今，在目前的研究中證明其皂苷成分有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、保肝和抗?jié)冏饔肹7,8]，此外，竹節(jié)參多糖類研究對(duì)竹節(jié)參的藥理作用及藥用價(jià)值展開也有廣闊的研究前景，本課題從抗炎和抗氧化方面初步探究竹節(jié)參多糖對(duì)APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷的影響，以期為其合理應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種雄性小鼠32只，體重約20～22 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK(鄂)2017-0018，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實(shí)驗(yàn).

1.2 藥材

竹節(jié)參藥材購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院鄧旭坤教授鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參的干燥根莖.

1.3 試劑

對(duì)乙酰氨基酚、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)檢測(cè)試劑盒(上海源葉生物科技)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)和微量還原型谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒(南京建成)；無水乙醇、葡萄糖、硫酸、苯酚(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑).

1.4 儀器

多功能酶標(biāo)儀(SMP-R8，北京維德維康司)；電子天平(TX223L型，日本島津)；紫外分光光度計(jì)(ZF-6型，上海嘉鵬).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 竹節(jié)參多糖的制備

取竹節(jié)參細(xì)粉，于95%乙醇中60 ℃回流3 h，脫脂.再加入80%乙醇60 ℃回流2 h，脫單糖和低聚糖.過濾，取藥渣烘干，加入10倍量蒸餾水80 ℃熱回流提取3次，每次2 h.合并3次濾液，減壓濃縮濾液至適量體積，向收集的濾液中加入乙醇直至乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%進(jìn)行醇沉.4 ℃過夜，過濾收集沉淀并烘干，得到粗多糖.加入適量的熱水使其溶解，除蛋白后流水透析48 h；透析液真空冷凍干燥，即得竹節(jié)參多糖(PSPJ).以葡萄糖為對(duì)照品, 用苯酚-硫酸法測(cè)得竹節(jié)參多糖中中性多糖的含量為70.61%；以葡萄糖醛酸為對(duì)照品, 用間羥基聯(lián)苯法測(cè)得竹節(jié)參多糖中糖醛酸的含量為18.59%[9].

2.2 竹節(jié)參多糖中單糖組分分析

單糖對(duì)照品的衍生化：分別精密稱取對(duì)照品鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、阿洛糖、半乳糖、甘露糖、肌醇10 mg于10個(gè)安瓿瓶中，再分別加入12 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶，置于電熱干燥箱中，90 ℃條件反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫，再加入0.5 mL醋酐，90 ℃反應(yīng)30 min，氮?dú)獯蹈珊?，?.0 mL氯仿溶解，備用[10].

竹節(jié)參多糖水解：精密稱量竹節(jié)參多糖10 mg于安瓿瓶中，加入10 mL 3 mol/L的三氟乙酸，120 ℃水解6 h，室溫冷卻后用氮?dú)獯蹈?，得單糖，干燥保存?zhèn)溆?

竹節(jié)參多糖供試品制備：空白溶液處理方法亦如上.

氣相色譜條件：載氣為氮?dú)?純度為99.999 %)，氫氣流量為50.0 mL·min-1；空氣流量400 mL·min-1，氮?dú)獯滴擦髁?0.0 mL·min-1，恒定壓力60.61 kPa，平均線速度34 cm·s-1；氣化室溫度240 ℃，檢測(cè)器溫度260 ℃，色譜柱初溫140 ℃，維持3 min，以10 ℃/min升至240 ℃，保持11 min，分流比20∶1，進(jìn)樣量為1 μL[10].

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥與造模

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、竹節(jié)參多糖低(50 mg·kg-1)、中(100 mg·kg-1)、高(200 mg·kg-1)劑量組，分籠飼養(yǎng).竹節(jié)參多糖組按劑量每日灌胃給藥，持續(xù)灌胃7 d，對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水；除對(duì)照組外，最后一次給藥2 h后，小鼠腹腔注射APAP(400 mg·kg-1)建立肝損傷模型.

2.4 樣本的采集與處理

觀察并記錄小鼠24 h內(nèi)的生存情況，取血后立即解剖，肝臟稱重并記錄，取少量肝臟于甲醛固定液中，用于HE染色；剩余肝臟放入-80 ℃保存用于生化分析.

2.5 肝組織病理形態(tài)學(xué)檢查

將固定好的肝組織進(jìn)行石蠟包埋，并切成厚度4～5 μm的切片.按標(biāo)準(zhǔn)的HE染色步驟進(jìn)行操作，顯微鏡下觀察、拍照.

2.6 相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

按照試劑盒說明書檢測(cè)血清和肝臟中ALT、AST、LDH、GSH和MDA的水平，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)小鼠血清中IL-6和IL-1β的含量.

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 竹節(jié)參多糖組分分析

根據(jù)出峰時(shí)間確定單糖的成分組成，通過峰面積歸一化法計(jì)算各個(gè)單糖的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù).按照項(xiàng)“2.2”的色譜條件，將10種對(duì)照品的單糖衍生物以及混合物分別進(jìn)樣，記錄各個(gè)單糖樣品的保留時(shí)間和峰位置，最后將空白溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖.通過面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算多糖成分中各單糖的組分.結(jié)果如圖1，單糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果見表1.

1)鼠李糖；2)半乳糖；3)阿拉伯糖；4)木糖；5)果糖；6)甘露糖；7)葡糖糖醛酸；8)半乳糖醛酸；9)葡萄糖；10)核糖a)混合標(biāo)準(zhǔn)品；b)竹節(jié)參多糖圖1 竹節(jié)參多糖樣品和標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of PSPJ sample and standards

表1 竹節(jié)參多糖中各單糖組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Mass fraction of monosaccharide components in PSPJ

由圖表可知竹節(jié)參多糖主要由葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡糖糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等構(gòu)成，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)百分比分別為53.41%、25.02%、13.62%、5.03%、1.10%、0.99%、0.82%.

3.2 竹節(jié)參多糖對(duì)肝損傷小鼠生存率的影響

竹節(jié)參多糖對(duì)肝損傷小鼠生存率的影響結(jié)果見圖2.如圖2所示，模型組小鼠的24 h生存率為20%，而低、中、高劑量組中小鼠生存率均有顯著提高(P<0.05或P<0.01)，中劑量給藥組小鼠24 h生存率升高到60%(P<0.01).說明竹節(jié)參多糖能顯著提高APAP誘導(dǎo)的肝損傷小鼠的生存率.

圖2 竹節(jié)參多糖對(duì)小鼠生存率的影響Fig.2 Effect of PSPJ on survival rate of mice

3.3 節(jié)參多糖對(duì)肝損傷小鼠肝功能的影響

肝臟指數(shù)可以間接反映肝臟的受損程度，而血清中AST、ALT和LDH水平能直接反映肝功能. 節(jié)參多糖對(duì)肝損傷小鼠肝功能的影響結(jié)果如下表2和圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組的肝指數(shù)、血清AST、ALT和LDH水平顯著升高(P<0.01或P<0.001)，顯示建模成功；與模型組相比，PSPJ給藥組均使得肝指數(shù)、血清AST、ALT和LDH有不同程度的下降(P<0.05或P<0.01)，且中劑量PSPJ對(duì)APAP誘導(dǎo)的肝損傷有更好的減緩效應(yīng)(P<0.01).

表2 竹節(jié)參多糖對(duì)APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝指數(shù)的影響Tab.2 Effects of PSPJ on liver index of APAP-induced liver injury in mice

與對(duì)照組比較，##P<0.01，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05, **P<0.01圖3 竹節(jié)參多糖對(duì)小鼠肝功能的影響Fig.3 Effect of PSPJ on liver function in mice

3.4 竹節(jié)參多糖對(duì)肝損傷小鼠肝組織GSH和MDA的影響

抗氧化因子GSH和氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA可以反映機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，竹節(jié)參多糖對(duì)肝損傷小鼠肝組織GSH和MDA的影響結(jié)果見圖4.

與對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖4 竹節(jié)參多糖對(duì)小鼠肝臟GSH和MDA含量的影響Fig.4 Effects of PSPJ on hepatic lever of GSH and MDA in mice

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組GSH顯著下降，而MDA顯著升高(P< 0.01)；與模型組比較，給PSPJ后，小鼠肝組織中的GSH水平明顯增高， MDA 的水平明顯降低(P<0.05或P<0.01).

3.5 竹節(jié)參多糖對(duì)肝損傷小鼠炎癥因子的影響

IL-1β和IL-6因子在APAP誘導(dǎo)肝損傷發(fā)生發(fā)展上有重要作用，APAP誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β可導(dǎo)致肝細(xì)胞加劇損傷以致死亡，竹節(jié)參多糖對(duì)肝損傷小鼠炎癥因子的影響結(jié)果見圖5.

與對(duì)照組比較, ###P<0.001；與模型組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001圖5 竹節(jié)參多糖對(duì)小鼠血清炎癥因子的影響Fig.5 Effect of PSPJ on serum inflammatory factorsin mice

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組中IL-1β和IL-6因子顯著升高(P< 0.001)；與模型組比較，PSPJ給藥組均能使IL-1β和IL-6不同程度的下降，且顯示PSPJ對(duì)APAP誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β炎癥因子具有更好的抑制作用(P<0.01或P<0.001).

3.6 竹節(jié)參多糖對(duì)肝損傷小鼠病理學(xué)影響

如圖6所示，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞整齊排列，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央.與對(duì)照組比較，APAP 模型組小鼠肝組織有明顯的出血，細(xì)胞排列紊亂，并伴有大量的炎性細(xì)胞.而與APAP組比較，PSPJ給藥組小鼠肝臟出血明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少等，且PSPJ中劑量改善效果較為顯著.

圖6 竹節(jié)參多糖對(duì)小鼠肝組織病理變化的影響Fig.6 Effect of PSPJ on the pathological changes of liver in mice

4 討論

肝臟是人體最大的免疫器官，也是最主要的代謝器官，是保證機(jī)體健康的重要器官[3].APAP在臨床上的廣泛使用，使得其誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的幾率和范圍顯著上升.竹節(jié)參多糖的作用研究越來越廣泛，它對(duì)抗腫瘤、抗衰老、降血脂等都有良好的作用.

多糖類成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類多樣，本文在提取竹節(jié)參多糖時(shí)采用60 ℃，有利于保護(hù)對(duì)熱不穩(wěn)定的成分.將得到的粗多糖反復(fù)透析，用苯酚-硫酸法測(cè)得其中性多糖的含量為70.61%，用間羥基聯(lián)苯法測(cè)得其糖醛酸的含量為18.59%，氣相色譜分析其組成為：葡萄糖(53.41%)、半乳糖醛酸(25.02%)、半乳糖(13.62%)、葡糖糖醛酸(5.03%)、鼠李糖(1.10%)、阿拉伯糖(0.99%)、木糖(0.82%)等，為竹節(jié)參多糖的藥理學(xué)研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ).

ALT、AST、LDH水平能反應(yīng)肝細(xì)胞損傷的情況.本文中竹節(jié)參多糖能夠有效降低小鼠肝臟和血清LDH，反應(yīng)藥物在一定程度上對(duì)肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用.ALT能反應(yīng)肝細(xì)胞的急性損傷，AST則反應(yīng)肝細(xì)胞的損傷程度，在使用竹節(jié)參多糖的情況下，ALT與AST數(shù)值均有降低，說明竹節(jié)參多糖不僅能夠有效減緩肝細(xì)胞損傷的情況，又對(duì)肝損傷細(xì)胞的修復(fù)有良好作用.

肝細(xì)胞中釋放的IL-1β與IL-6在一系列炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用. IL-1β促炎因子能夠使肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)延長(zhǎng)和加劇，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞；而IL-6能夠使肝細(xì)胞再生和修復(fù).在本實(shí)驗(yàn)中，竹節(jié)參多糖能夠抑制有效抑制促炎介質(zhì)IL-1β濃度，并且對(duì)IL-6的濃度無顯著影響，說明竹節(jié)參多糖對(duì)APAP誘導(dǎo)的肝損傷細(xì)胞有減輕作用，還能保證受損肝細(xì)胞的修復(fù)再生.另外，竹節(jié)參多糖有效提高了APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠的生存率并且緩解小鼠肝臟的病理學(xué)變化.本文首次證明竹節(jié)參多糖能夠有效緩解對(duì)APAP 誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，可能是通過抗氧化和抗炎機(jī)制來發(fā)揮療效，并為竹節(jié)參的進(jìn)一步研究提供了可能的依據(jù).