耿紅，裴婷，苗莉云，甘喆 ，劉婷，張鵬*

(1 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074；2 山西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，晉中 030619)

植物內(nèi)生菌(endophyte)是指某一段生活史或者全部生活史存在于宿主植物的健康組織和器官中，而通常不會引起疾病明顯癥狀的微生物. 內(nèi)生菌可影響宿主植物的生長發(fā)育，有研究表明，內(nèi)生菌可以促進(jìn)天麻種子的萌發(fā)[1]、地黃的生長[2]. 內(nèi)生菌也可促進(jìn)藥用植物有效成分的合成，比如一些內(nèi)生菌能促進(jìn)黨參中多糖的積累[3]、蒼術(shù)中香精的積累[4]. 植物內(nèi)生菌作為一個潛在的資源寶庫，日益受到人們的重視.

重樓是我國傳統(tǒng)中藥材，具有治療蛇毒以及抗腫瘤作用. 目前關(guān)于重樓內(nèi)生菌的研究極少. Yang等[5]分析了不同栽培年限的滇重樓根中內(nèi)生菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)8年生根中內(nèi)生細(xì)菌多樣性低于4年和6年生，而內(nèi)生真菌多樣性高于4年和6年生. 王茜等[6]分析了云南3個縣野生滇重樓的749株內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)樣地生境和組織部位影響內(nèi)生真菌的多樣性.

本文通過對道地產(chǎn)區(qū)滇重樓根部內(nèi)生細(xì)菌的分離及其多樣性進(jìn)行分析，初步揭示滇重樓根組織的內(nèi)生細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)及其優(yōu)勢類型，并進(jìn)一步通過與小麥幼苗的共培養(yǎng)，篩選促生菌，為后期深入分析重樓不同組織的內(nèi)生菌的結(jié)構(gòu)特征以及利用促生菌改良重樓種苗繁育技術(shù)的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

滇重樓植株材料于2018年4月采集自中國云南省麗江市區(qū)古城區(qū)七河鎮(zhèn)萬農(nóng)生物科技有限公司的種植基地. LA培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于內(nèi)生細(xì)菌的分離，LB培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基用于內(nèi)生細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)，1/2PDA培養(yǎng)基用于共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基組成和配制方法參照于鵬飛[7]的方法. T5 super Mix Kit購自武漢擎科. 27F和1492R引物序列參照文獻(xiàn)[8]，由奧科鼎盛合成.

1.2 植物樣品的處理及內(nèi)生菌的分離

(1)自來水洗掉滇重樓根表面的泥土，削除外皮. (2)無菌水沖洗1遍，1% NaClO溶液浸泡2 min，無菌水沖洗3次，75%乙醇浸泡2 min，無菌水浸泡3次(2 min/次)(取最后一次浸泡材料的水，涂布平板，檢測消毒效果). (3)無菌條件下切取0.1 g根，加入1 mL無菌水輕柔研磨. (4)適當(dāng)稀釋后，涂布在分離培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，并根據(jù)細(xì)菌生長情況，挑取新長出的菌株至新的培養(yǎng)基，之后，通過劃線法純化獲得各個內(nèi)生細(xì)菌的單克隆.

1.3 內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析

將各內(nèi)生細(xì)菌分別接種到5 mL LB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24～48 h后，取0.5 μL菌液做模版，采用T5 Super Mix以及27F和1492R引物擴(kuò)增各個內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列，PCR條件為：95 ℃ 10 min；93 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)；72 ℃、10 min. 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由奧科鼎盛進(jìn)行測序.

各內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列分別進(jìn)行BLAST比對分析，確定其分類，再用Mega 7進(jìn)行序列相似性分析，以Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9].

1.4 促生菌的篩選

(1)分別取5 μL各個內(nèi)生細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物，均勻涂布于1/2PDA培養(yǎng)基；(2)小麥種子經(jīng)75%乙醇表面消毒3 min，無菌水浸洗5次(2 min/次)，無菌濾紙吸干水分后，接入涂布有內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)基上；對照接種于沒有涂布內(nèi)生菌的培養(yǎng)基；(3) 28 ℃共培養(yǎng)7 d后，測量小麥幼苗的株高、根長、莖粗. 將株高增長30%、根長增長30%或莖粗增長10%的內(nèi)生細(xì)菌定義為促生菌. 每個實(shí)驗(yàn)5個生物學(xué)重復(fù)，隨機(jī)取其中20株小麥幼苗進(jìn)行數(shù)據(jù)測量并取平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離及多樣性分析

采用兩種培養(yǎng)基從0.1 g滇重樓根中共分離獲得228株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)16S rDNA序列分析，這些內(nèi)生細(xì)菌歸屬于4個門(放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門)，其中變形菌門為優(yōu)勢門(74.12%)；5個綱(微球菌綱、黃桿菌綱、芽孢桿菌綱、γ-變形菌綱、變形菌綱)，其中γ-變形菌綱為優(yōu)勢綱(63.60%)；7個目(微球菌目、黃桿菌目、芽孢桿菌目、伯克氏菌目、腸桿菌目、假單孢桿菌目、黃色單胞菌目)，其中假單孢桿菌目為優(yōu)勢目(40.35%). 11個科(節(jié)桿菌科、黃桿菌科、類芽孢桿菌科、葡萄球菌科、芽孢桿菌科、產(chǎn)堿菌科、耶爾森菌科、腸桿菌科、歐文菌科、假單胞桿菌科、黃色單胞菌科)，其中假單胞桿菌科為優(yōu)勢科(40.35%)；13個屬，其中假單胞菌屬(40.35%)和芽孢桿菌屬(22.37%)為優(yōu)勢屬(圖1，2).

2.2 促生菌的篩選

分別將228株內(nèi)生細(xì)菌與小麥幼苗共培養(yǎng)7 d，發(fā)現(xiàn)171株內(nèi)生細(xì)菌導(dǎo)致與其共培養(yǎng)的小麥幼苗死亡或生長緩慢，57株內(nèi)生細(xì)菌的共培養(yǎng)小麥幼苗可以正常生長. 通過測量共培養(yǎng)7 d的小麥幼苗的株高、根長、莖粗，發(fā)現(xiàn)10株內(nèi)生細(xì)菌對小麥幼苗的生長有明顯的促進(jìn)作用(表1). 其中，YNR32016(腸桿菌屬)、YNR32067(沙雷氏菌屬)、YNR32084(沙雷氏菌屬)對小麥株高促進(jìn)效果較好，與對照(9.69±1.4 cm)相比，株高增長率分別為72.43%、71.24%、53.14%. 對小麥根長促進(jìn)效果尤為明顯的是YNR32041(產(chǎn)堿菌屬)、YNR32084(沙雷氏菌屬)、YNR32052(類香味菌屬)，與對照(2.8±0.4 cm)相比，根長增長率分別為602.51%、354.12%、328.57%. 對小麥莖粗促進(jìn)效果較好的3株菌株為YNR32046(芽孢桿菌屬)、YNR32045(類香味菌屬)、YNR32052(類香味菌屬)，與對照(1.85±0.43 mm)相比，莖粗增長率分別為26.87%、23.62%、19.58%. 該結(jié)果也表明，不同屬的菌株對小麥幼苗同一組織的促生作用不同，預(yù)示不同屬的內(nèi)生菌對植株同一組織的促生機(jī)制或促生能力存在差異. 同時，該結(jié)果也表明同一個菌株對小麥不同組織的促進(jìn)效果不同，因此，要想實(shí)現(xiàn)利用內(nèi)生菌促進(jìn)植株特定組織的生長，必須先針對性地篩選促進(jìn)該組織生長的特定菌株.

A～C分別為共培養(yǎng)4 d的對照、YNR32016、YNR32067的生長情況；D～F分別為共培養(yǎng)7 d的對照、YNR32016、YNR32067的小麥幼苗圖3 滇重樓根內(nèi)生細(xì)菌與小麥共培養(yǎng)Fig.3 Co-cultivation of endophytic bacteria isolated from P. polyphylla var.yunnanensis roots with wheat seedlings

表1 滇重樓根內(nèi)生細(xì)菌對小麥的促生作用Tab.1 The promoting effect of endophytic bacteria of P. polyphylla var.yunnanensis on wheat seedlings

3 討論

內(nèi)生菌的多樣性或其群體結(jié)構(gòu)影響宿主植物的藥用物質(zhì)的合成[10]. 目前，關(guān)于藥用植物內(nèi)生菌研究已有報(bào)道. 陽湖榮等[11]從一年生白術(shù)的1.0 g根組織中共分離到49株內(nèi)生細(xì)菌，這些內(nèi)生細(xì)菌歸屬到11個屬，其中優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬(46.94%). 廖秋紅等[12]從6年生滇重樓根組織中共分離到22株內(nèi)生細(xì)菌，可歸屬到9個屬. 本研究從5年生滇重樓的0.1 g根中共獲得228株內(nèi)生細(xì)菌，可歸屬到13個屬，其中假單胞菌屬和芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬，預(yù)示芽孢桿菌屬、假單胞菌屬內(nèi)生菌可能對重樓根中藥用成分的合成有較大的影響. 本研究分析的5年生滇重樓根與廖秋紅等[12]分析的6年生滇重樓根都含有5個屬(葡萄球菌屬、變形菌屬、產(chǎn)堿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、微桿菌屬)的內(nèi)生細(xì)菌. 但本研究的5年生滇重樓根中內(nèi)生細(xì)菌的9個屬(類香味菌屬、類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、Lelliottia、泛生菌屬)，與廖秋紅等[12]報(bào)道的6年生滇重樓根中內(nèi)生細(xì)菌的4個屬(表皮葡萄菌球菌屬、無色桿菌屬、嗜麥寡養(yǎng)單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬)存在差異，這可能與研究所用滇重樓植物材料的生長年限以及采集地區(qū)有關(guān).

許多內(nèi)生菌具有促進(jìn)植物生長、種子萌發(fā)以及抗菌和抑菌的作用，例如Mishra等[13]從藥用植物天竺葵植株中分離得到2株具有促生長活性的內(nèi)生細(xì)菌. 宋發(fā)軍等[14]發(fā)現(xiàn)重樓內(nèi)生細(xì)菌可以促進(jìn)冬小麥的種子萌發(fā). 許多植物內(nèi)生菌還具有許多抗菌和抑菌作用，艾洪蓮等[15]發(fā)現(xiàn)籃狀菌屬 (Talaromyces) 、毛殼菌屬 (Chaetomium) 和附球菌屬 (Epicoccum) 內(nèi)生真菌對馬鈴薯枯萎病、黑痣病和早疫病有明顯拮抗作用.

本研究分別將228株內(nèi)生細(xì)菌與小麥幼苗共培養(yǎng)，初步篩選獲得10株促進(jìn)小麥生長的內(nèi)生細(xì)菌，為進(jìn)一步利用促生菌改良重樓種苗繁育技術(shù)的研究提供了菌株資源，同時，沒有促生作用的菌株也為后期篩選具有抗菌和抑菌作用的微生物提供了資源.