孫燕，萬忠均，毛亮，吳軼凡，楊婭楠，阿如娜

(中南民族大學 生命科學學院，武漢神經(jīng)科學與神經(jīng)工程研究所，武漢 430074)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)是一種封閉的微環(huán)境，其血腦屏障限制了免疫細胞和相關(guān)分子進入CNS，生理狀態(tài)下定居CNS的膠質(zhì)細胞能維持微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1].其中，星形膠質(zhì)細胞(astrocyte)具有復雜多樣的結(jié)構(gòu)和功能，參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、組織修復與再生等功能，并對多種神經(jīng)疾病病理機制發(fā)揮著重要作用[2].小膠質(zhì)細胞(microglia)是CNS 定居的巨噬細胞，具有抗原呈遞、吞噬功能和分泌細胞因子等功能[3].神經(jīng)元細胞(neuron)具有長突起，由胞體與細胞突起構(gòu)成，組成神經(jīng)系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)的基本單位.

高遷移率族蛋白 1(HMGB1)是一種非組蛋白染色體結(jié)合核蛋白[4]，幾乎表達在所有真核細胞內(nèi)，維持細胞核環(huán)境穩(wěn)態(tài)，影響核染色質(zhì)功能和基因調(diào)控[5]. HMGB1的不同生理功能主要依賴于它在細胞內(nèi)的定位和分布.當細胞損傷時或在某些促炎癥性細胞因子作用下，HMGB1從核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)位或釋放到細胞外調(diào)節(jié)機體免疫應答和炎癥反應[6]；生理和應激狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元HMGB1表達模式和釋放特征尚未完全闡明.在機體遺傳發(fā)育過程中 CNS 定居的神經(jīng)細胞表達HMGB1，展現(xiàn)出復雜的表達量、細胞定位和亞細胞定位的變化，提示HMGB1可能具有CNS特異性的功能和釋放特征，在CNS 組織特異性疾病中發(fā)揮重要作用.

本文利用免疫印跡和細胞免疫熒光雙標記方法，觀察U87, BV2和N2a和原代星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元HMGB1表達模式的改變以及不同應激狀態(tài)下U87,BV2和N2a的HMGB1釋放特征.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：生理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞核表達HMGB1；應激狀態(tài)下，PTX和/或ATP刺激細胞后其HMGB1釋放特征不同，其中U87和BV2主動分泌HMGB1，N2a細胞被動釋放HMGB1.

1 實驗材料

1.1 動物和細胞株

8～10周雄性和雌性C57BL/6小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，飼養(yǎng)于溫度濕度可控的中南民族大學實驗動物中心SPF級動物房，遵照《中南民族大學實驗動物使用與福利指導手冊》；小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞Neuro-2a(N2a)、小鼠小膠質(zhì)細胞(BV2)、人腦膠質(zhì)瘤細胞(U87)由本室保存.

1.2 實驗試劑

DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基、新生牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶、Neurobasal-A培養(yǎng)基、B27、L-谷氨酰胺、PFA和DAPI(GIBCO)；RIPA單去污劑裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、牛血清白蛋白BSA、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、山羊抗兔IgG(H+L)、SDS-PAGE試劑盒、PVDF膜(碧云天)，抽提胞漿蛋白-核蛋白試劑盒(美國Viagene)；SM0671預染蛋白Marker、BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific)；ECL化學發(fā)光試劑盒(Biosharp)；細胞免疫熒光染色一抗和熒光二抗(見表1).

表1 細胞免疫熒光染色一抗和二抗Tab.1 Primary antibody and second antibody of cell immunofluorescent staining

1.3 實驗儀器

-80 ℃冰箱(中科美菱)；Western Blot模具及電泳槽(LAB-EYE MP-4，上海創(chuàng)萌)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-8型，北京六一)；化學發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiScope 3300 mini，上海勤翔科學儀器)；超凈化工作臺(SW-CJ-1FD型，蘇州凈化)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific)；激光共聚焦顯微鏡(FV-500，日本Olympus).

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將N2a、BV2和 U87細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 d全量換液，每4 d以0.25%胰蛋白酶消化和傳化.免疫熒光檢測所需的爬片細胞均處于對數(shù)生長期，且細胞生長至90%融合狀態(tài).

2.2 大腦皮層原代星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元培養(yǎng)

分離新生C57BL/6小鼠的大腦皮層，將皮層剪碎成約1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，0.25%胰蛋白酶消化 15 min，加入等體積含10% FBS的 DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，4 ℃ 800 r/min離心8 min后棄上清液，DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞沉淀并過濾.星形膠質(zhì)細胞以1×107個/mL細胞接種于25 cm2培養(yǎng)皿中，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 min，內(nèi)皮細胞貼壁生長后，取上清接種于新的培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng).24 h后全量更換含10% FBS的 DMEM/F12完全培養(yǎng)基，每4 d更換完全培養(yǎng)基.培養(yǎng)18 d進行原代星形膠質(zhì)細胞的分離、純化、傳代和鑒定，得到98%以上純化的星形膠質(zhì)細胞.

大腦皮層原代神經(jīng)元以2×105個/mL細胞密度接種6孔板培養(yǎng)，4 h后將DMEM/F12培養(yǎng)基全量更換成含2% B27和1% L-谷氨酰胺的 Neurobasal-A培養(yǎng)基，維持培養(yǎng)24 h后全量更換培養(yǎng)基，每隔 3 d 半量更換維持培養(yǎng)基.大腦皮層原代神經(jīng)元培養(yǎng)7 d，進行后續(xù)Western Blot或細胞免疫熒光檢測.

2.3 LPS, PTX, PTX/ATP刺激細胞

將細胞按1×106個/孔接種6孔板，每孔加入1 mL含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，分別用500 ng/mL LPS、200 ng/mL PTX處理細胞，24 h后收集刺激后的培養(yǎng)上清和細胞. PTX實驗組：使用200 ng/mL PTX分別處理U87, BV2和N2a細胞，PTX刺激24 h后收集刺激后的培養(yǎng)上清，為單獨PTX實驗組. PTX刺激24 h后換用6 mM ATP繼續(xù)刺激培養(yǎng)45 min(各孔再加入1 mL含有ATP新鮮的含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基)，再收集ATP刺激后的培養(yǎng)上清，為PTX/ATP實驗組.

2.4 收集細胞培養(yǎng)上清和檢測細胞成活率

采用50 mL和3 kDa 超濾管收集細胞培養(yǎng)上清，4 ℃ 4500 r/min離心45 min將上清濃縮6倍后，Western Blot檢測濃縮上清中HMGB1蛋白表達.并用0.25%胰蛋白酶消化U87, BV2和N2a細胞，預冷PBS洗滌、重懸，取100 μL用于臺盼藍拒染法分別檢測U87, BV2和N2a生存率.

2.5 Western Blot檢測HMGB1蛋白表達

采用Western Blot分別檢測貼壁細胞中HMGB1總蛋白、胞漿蛋白和核蛋白的表達：將培養(yǎng)瓶置于冰盒上操作，PBS 漂洗貼壁細胞 3 次，加入100 μL含蛋白酶抑制劑(100 μg/mL PMSF和1 μg/mL aprotimin)的RIPA搖勻，冰上放至30 min，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，收集上清進行SDS-PAGE檢測目的蛋白HMGB1表達.胞漿蛋白-核蛋白的抽提操作流程參見貼壁細胞的胞漿蛋白-核蛋白試劑盒說明書.取3 μL蛋白樣本用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，所有樣品上樣量均為40 μg蛋白質(zhì).

SDS-PAGE電泳條件：積層膠80 mV，分離膠120 mV，電泳2.5 h；蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，選擇恒流200 mA，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜1 h.用5%脫脂奶粉4 ℃封閉PVDF膜過夜, TBST漂洗膜4次，每次10 min; 加入5%脫脂牛奶稀釋的一抗(濃度分別為1∶8000 HMGB1、1∶1000 β-actin、1∶4000 Lamin B1)，室溫孵育3 h. TBST漂洗膜4次，每次10 min, 分別加入1∶4000 5%脫脂牛奶稀釋HRP標記的二抗，室溫搖床孵育膜1 h; TBST漂洗膜6次，每次10 min; ECL化學發(fā)光試劑盒顯色反應，化學發(fā)光成像系統(tǒng)拍照.

2.6 細胞免疫熒光雙標記檢測

以1×103個/mL細胞密度接種至12 孔培養(yǎng)板內(nèi)0.5 cm×0.5 cm 蓋玻片，待細胞生長至90%融合狀態(tài).TBS 漂洗蓋玻片3次，每次5 min.4% PFA 固定細胞 15 min. TBS 漂洗蓋玻片3次，每次5 min.5% BSA室溫封閉2 h，分別加入不同來源的一抗，室溫孵育 2 h后置于 4 ℃孵育過夜.TBS 漂洗蓋玻片3次，每次5 min.加入熒光標記的二抗，37 ℃避光孵育 1 h. TBS 漂洗蓋玻片3次，每次5 min.加入 1∶10000 TBS 稀釋的DAPI染細胞核 5 min. TBS 漂洗蓋玻片3次，每次5 min.抗熒光淬滅封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡拍照記錄.

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 U87細胞核表達HMGB1

傳代培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細胞(U87)，鏡下觀察培養(yǎng)7 d的U87細胞，顯示胞體貼壁生長，生長密度大，呈梭形或三角形(見圖1a).提取 U87細胞總蛋白、胞漿蛋白及核蛋白進行Western Blot檢測，顯示U87細胞核表達HMGB1蛋白(見圖1b).用免疫熒光雙重染色對U87細胞的HMGB1和星形膠質(zhì)細胞特異性標記物(GFAP+)進行標記，細胞核(DAPI+)復染，進一步證實HMGB1與GFAP雙陽性細胞有共定位，且HMGB1定位于細胞核(見圖1c).以上結(jié)果表明：生理條件U87細胞核表達HMGB1.

圖1 U87細胞核表達HMGB1Fig.1 Nuclear location of HMGB1 in U87

3.2 BV2細胞核表達HMGB1

傳代培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細胞(BV2)，鏡下觀察培養(yǎng)7 d后BV2細胞的生長狀態(tài)，顯示BV2細胞胞體貼壁生長，生長密度大，呈圓形或橢圓形(見圖2a).提取BV2細胞總蛋白、胞漿蛋白及核蛋白進行Western Blot檢測，顯示BV2細胞核表達HMGB1蛋白(見圖2b).用免疫熒光雙重染色對BV2細胞的HMGB1和小膠質(zhì)細胞特異性標記物(CD68+)進行標記，細胞核(DAPI+)復染，顯示HMGB1與CD68雙陽性細胞有共定位，且HMGB1定位于細胞核(見圖2c).以上結(jié)果表明：生理條件下BV2細胞核表達HMGB1.

圖2 BV2細胞核表達HMGB1Fig.2 Nuclear location of HMGB1 in BV2

3.3 N2a細胞核表達HMGB1

傳代培養(yǎng)小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞(N2a)，鏡下觀察培養(yǎng)7 d后的N2a細胞，顯示胞體貼壁生長，生長密度大，呈圓形或梯形，具有軸突樣結(jié)構(gòu)(見圖3a).提取N2a細胞總蛋白、胞漿蛋白及核蛋白進行Western Blot檢測，顯示N2a細胞核表達HMGB1(見圖3b).對N2a細胞中HMGB1與神經(jīng)元特異性標記物(NeuN+)進行免疫熒光雙重染色，細胞核(DAPI+)復染，顯示HMGB1與NeuN雙陽性細胞有共定位，且HMGB1定位于細胞核(見圖3c).以上結(jié)果表明：生理條件下N2a細胞核表達HMGB1.

圖3 N2a細胞核表達HMGB1Fig.3 Nuclear location of HMGB1 in N2a

3.4 小鼠大腦皮層原代星形膠質(zhì)細胞細胞核表達HMGB1

原代培養(yǎng)新生 C57BL/6小 鼠的大腦皮層星形膠質(zhì)細胞，對培養(yǎng)18 d的星形膠質(zhì)細胞進行分離、純化和傳代，第4代原代貼壁生長，呈細長型，邊緣清晰，立體感強(見圖4a).

圖4 小鼠大腦皮層原代星形膠質(zhì)細胞細胞核表達HMGB1Fig.4 Nuclear location of HMGB1 in mouse cerebral cortexprimary astrocytes

同時，提取星形膠質(zhì)細胞的總蛋白、胞漿蛋白及核蛋白進行Western Blot檢測，顯示原代星形膠質(zhì)的細胞核表達HMGB1(見圖4b).此外，對星形膠質(zhì)細胞的純度進行鑒定，星形膠質(zhì)細胞特異性標記物(GFAP)與細胞核DAPI進行免疫熒光雙重染色，顯示星形膠質(zhì)細胞的純度達到98%以上(見圖4c).以上結(jié)果表明：生理條件下小鼠大腦皮層原代星形膠質(zhì)的細胞核表達HMGB1.

3.5 小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元細胞核表達HMGB1

原代培養(yǎng)新生 C57BL/6小 鼠的大腦皮層神經(jīng)元，鏡下分別觀察培養(yǎng)第3, 5, 7 d神經(jīng)元的生長和形態(tài)變化，結(jié)果顯示：第3 d從神經(jīng)元胞體的伸出突起逐漸增多并延長，大多以錐體細胞為主；第5 d神經(jīng)元開始成熟，胞體暈光明顯，胞質(zhì)和核清晰可見，有立體感，折光性強；第7 d神經(jīng)元胞體逐漸增大，突起增粗，邊緣清晰，立體感強，相鄰突起相互交織成網(wǎng)，形成更加稠密的神經(jīng)網(wǎng)絡(見圖5a).神經(jīng)元特異性標記物(NeuN+)進行免疫熒光染色，細胞核(DAPI+)復染.取第7 d原代培養(yǎng)，神經(jīng)元純度達到99%以上(見圖5b). 同時，提取第7 d神經(jīng)元的總蛋白、胞漿蛋白及核蛋白進行Western Blot檢測，顯示神經(jīng)元的細胞核表達HMGB1(見圖5c).以上表明：生理條件下小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元細胞核表達HMGB1.

圖5 小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元細胞核表達HMGB1Fig.5 Nuclear location of HMGB1 in mouse cerebral cortex primary neurons

3.6 U87、BV2和N2a細胞HMGB1釋放特征不同

LPS, PTX, PTX/ATP分別處理U87,V2和N2a細胞，3 KDa超濾管將刺激后的培養(yǎng)上清濃縮6倍，Western Blot檢測濃縮上清中HMGB1蛋白表達，臺盼藍拒染法檢測細胞生存率(見圖6a和6b).與對照組Medium比較，PTX和PTX/ATP處理組的U87和BV2細胞上清中均顯示HMGB1蛋白表達，但細胞存活率無統(tǒng)計學差異.用臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞，陽性對照24 h-LPS刺激不會導致 BV2細胞死亡，存活率達到100%.

相反，單獨PTX和PTX/ATP處理組的N2a細胞上清中也顯示HMGB1蛋白表達，但細胞存活率明顯下降(見圖6c). 與Medium組相比較，單獨PTX處理組和PTX/ATP處理組均具有顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.01)；與PTX處理組相比較，PTX/ATP處理組細胞存活率明顯下降，具有顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.05).以上結(jié)果表明：單獨PTX, PTX/ATP刺激細胞后其HMGB1釋放特征不同，其中U87和BV2主動分泌HMGB1，N2a細胞被動釋放HMGB1.

與Medium組相比，**P<0.01；與PTX組相比，#P<0.05圖6 體外BV2, U87和N2a 細胞HMGB1釋放特征Fig.6 In vitro release characteristics of HMGB1 from U87, BV2 and N2a

4 討論

作為一種核因子，警報素HMGB1在細胞壞死或受損時從細胞核釋放到胞外，因此，病理生理狀態(tài)下HMGB1的功能和釋放特征備受關(guān)注.胞外HMGB1主要通過結(jié)合晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)或Toll樣受體(TLR)如TLR2和TLR4分泌大量的促炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6以及趨化因子和粘附分子，參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦卒中[7].此時，胞外HMGB1有助于機體無菌炎癥反應.

大腦發(fā)育的不同階段HMGB1呈現(xiàn)出復雜的時間、空間表達模式變化，在E14.5胚胎期大腦皮層中HMGB1主要定位于細胞核，但約有1%細胞的胞質(zhì)表達HMGB1；在E16胚胎期，分散表達在細胞核內(nèi)的HMGB1從腦室下區(qū)向大腦皮層遷移;隨著胚胎期大腦發(fā)育HMGB1表達逐漸下降，而成年小鼠HMGB1在具有神經(jīng)再生能力的區(qū)域表達升高[8]，提示了HMGB1在CNS發(fā)揮著獨特作用. CNS定居細胞主要有星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，HMGB1不同的病理生理功能主要依賴于它在細胞內(nèi)的定位和分布.本文研究發(fā)現(xiàn)：生理條件下，CNS來源的星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的胞核均表達HMGB1；單獨PTX, PTX及ATP能誘導U87和BV2主動分泌HMGB1，N2a細胞被動釋放HMGB1. 其應激狀態(tài)是否促進HMGB1翻譯后修飾(乙?；?、甲基化、磷酸化和聚核糖基化)來協(xié)助HMGB1出核釋放胞外仍有待進一步研究.本文為后續(xù)利用中國人腦庫中心(CBBC)資源[9]進一步研究HMGB1在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)的作用機制奠定了基礎.