沈金花，韓淑慧，時(shí)順波

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

哮喘是一種慢性炎癥性疾病，由基因和環(huán)境相互作用引起的，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[1].哮喘會引起氣短、胸悶和咳嗽等癥狀，這些癥狀與可變的呼氣氣流有關(guān)，即由于支氣管收縮(氣道狹窄)、氣道壁增厚和黏液增多而導(dǎo)致肺部呼吸困難[2].通過適當(dāng)?shù)腎CS治療或ICS/LABA治療，可以減少哮喘惡化的頻率，但并能完全阻止[3]，且哮喘長期治療成本高，容易對藥物產(chǎn)生抗性，所以其它治療哮喘的生物制劑正在研究中.

白鮮堿(dictamnine)是一種具有多種生物活性的小分子生物堿，可從多種植物中提取，也可以人工合成(分子結(jié)構(gòu)見圖1).已證明它具有多種生物學(xué)功能，包括抗炎、抗真菌、抗血管生成和抗癌活性[4].但目前其在氣管平滑肌的作用尚未見報(bào)道，故本文通過使用高鉀(H-K)和乙酰膽堿(ACh)預(yù)收縮的氣管平滑肌，探究白鮮堿是否具有舒張氣管平滑肌的異常收縮和擴(kuò)張氣管的作用.

圖1 白鮮堿分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of dictamnine

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

白鮮堿(上海源葉生物科技有限公司)；乙酰膽堿(ACh)、硝苯地平、Pyr3、GdCl3、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶、牛血清蛋白(BSA)、二硫蘇糖醇(DTT)(美國Sigma).

高鈣溶液、高鉀溶液、細(xì)胞外液、電極內(nèi)液、酶溶液Ⅰ和酶溶液Ⅱ，按參考文獻(xiàn)[6]配制.

BABL/c小鼠，雄性，SPF級，6～8周齡，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心.在控溫、控濕條件下，自由飲水進(jìn)食.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和處理均遵照《中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與福利指導(dǎo)手冊》.

離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(HV-4，成都泰盟軟件有限公司)；生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420S，成都泰盟軟件有限公司)；張力換能器(JH-2，航天醫(yī)學(xué)工程研究所)；膜片鉗放大器(HEKA，EPC-10，德國Lambrecht)；玻璃微電極(外徑1.4 mm，南京泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠).

1.2 小鼠離體氣管環(huán)的處理

斷頸法處死小鼠，完整取出主氣管和肺置于含預(yù)冷的PSS溶液的解剖盤中，在體式顯微鏡下剪去氣管周圍的組織.在靠近三角區(qū)處取適當(dāng)長度的氣管，插入兩個(gè)三角環(huán)，一個(gè)固定，一個(gè)與張力換能器相連，將氣管置于含6 mL PSS溶液的水浴槽中，37 ℃溫浴，持續(xù)通氧.調(diào)前負(fù)荷為300 mg，每15 min換一次PSS溶液并再次調(diào)前負(fù)荷，共4次平衡.平衡60 min后加入80 mmol·L-1KCl或100 μmol·L-1ACh預(yù)刺激氣管，當(dāng)氣管充分收縮后洗脫恢復(fù)至基線，待氣管休息30 min后開始實(shí)驗(yàn)[5].藥物引起的舒張作用以氣管異常收縮的百分比(均數(shù)±SEM)表示.

1.3 小鼠氣管平滑肌細(xì)胞的制備

斷頸法處死小鼠，快速取出主氣管和肺置于含預(yù)冷的rTASM解離液的解剖盤中，分離出主氣管及支氣管后，沿肌條與軟骨環(huán)的連接處剪開，去除軟骨組織得到干凈的肌條.將肌條放入37 ℃預(yù)熱10 min的酶溶液Ⅰ中消化22 min，然后將肌條轉(zhuǎn)入預(yù)熱的酶溶液Ⅱ中消化8 min.將肌條清洗2次，轉(zhuǎn)入含300 μL BSA的離心管中，小心打散后置于冰上備用.

1.4 全細(xì)胞電流記錄

通過膜片鉗放大器檢測全細(xì)胞VDCCs電流.前置電壓為-70 mV，維持50 ms，給予細(xì)胞去極化階段刺激500 ms，刺激電壓從-70 mV逐漸增加至+40 mV，每10 s增加10 mV.通過PatchMaster軟件分析電流信號，Origin 8分析作圖[6].

2 結(jié)果與分析

2.1 白鮮堿對高鉀預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用

肌細(xì)胞的收縮與胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度有關(guān).使用80 mmol·L-1KCl誘發(fā)氣管平滑肌細(xì)胞的電壓依賴性鈣離子通道(VDCCs)通道開放，使氣管平滑肌痙攣，氣管環(huán)異常收縮[7].白鮮堿能成劑量依賴性地抑制這種異常收縮(圖2a，2b).

a) 白鮮堿劑量依賴的抑制高鉀預(yù)收縮的氣管環(huán); b) 白鮮堿抑制高鉀預(yù)收縮的氣管環(huán)的量效曲線(n=6);c) 10 μmol·L-1 硝苯地平完全阻斷高鉀引起的氣管環(huán)收縮;d) 白鮮堿對靜息氣管環(huán)無影響圖2 白鮮堿對高鉀預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用Fig.2 Relaxation effect of dictamnine on high K+ pre-contracted tracheal ring

其最大舒張值為(93.72±1.06)%，收縮被抑制一半時(shí)的濃度(IC50)為(51.6±1.02)%.硝苯地平(nifedipine)是一種VDCCs的選擇性阻斷劑，10 μmol·L-1硝苯地平可以完全阻斷80 mmol·L-1KCl誘導(dǎo)的氣管收縮(圖2c).白鮮堿對靜息條件下的氣管張力無影響(圖2d).

2.2 白鮮堿抑制高鉀引起的外鈣內(nèi)流

當(dāng)細(xì)胞外無Ca2+存在的情況下，高鉀不能引起氣管的收縮，當(dāng)細(xì)胞外補(bǔ)充Ca2+后，可以立即引發(fā)氣管收縮，113 μmol·L-1白鮮堿可抑制此收縮(圖3a).提前孵育113 μmol·L-1白鮮堿，細(xì)胞外補(bǔ)充Ca2+后引起的收縮反應(yīng)被抑制(圖3b)，說明它對高鉀預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用是通過抑制VDCCs通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流來產(chǎn)生的.

a) 無外鈣條件下高鉀不引起氣管收縮;b) 孵育白鮮堿抑制外鈣內(nèi)流引起的氣管收縮圖3 白鮮堿抑制高鉀引起的外鈣內(nèi)流Fig.3 Inhibitiory effect of dictamnine on Ca2+ influx evoked by high K+

2.3 白鮮堿阻斷VDCCs電流

用全細(xì)胞模式記錄單個(gè)氣管平滑肌細(xì)胞的VDCCs電流，與對照組相比加入10 μmol·L-1硝苯地平或316 μmol·L-1白鮮堿抑制了VDCCs電流(圖4a)，當(dāng)電壓為10 mV時(shí)得到最大激活電流(圖4b)，該電流能被10 μmol·L-1硝苯地平和316 μmol·L-1白鮮堿完全阻斷.表明白鮮堿可能發(fā)揮類似硝苯地平的作用，抑制VDCCs電流，可通過阻斷VDCCs，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平來緩解高鉀誘導(dǎo)的氣管平滑肌收縮.

a) 白鮮堿對氣管平滑肌細(xì)胞的VDCCs時(shí)間-電流圖;b) 白鮮堿對氣管平滑肌細(xì)胞的VDCCs電壓-電流圖圖4 白鮮堿阻斷VDCCs電流的作用Fig.4 Inhibitiory effect of VDCCs currents blocked by dictamnine

2.4 白鮮堿對ACh預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用

細(xì)胞內(nèi)Ca2+的調(diào)控除VDCCs外，還有多種離子通道參與.乙酰膽堿(ACh)是哮喘研究常用的誘發(fā)劑，它能激活電壓依賴性鈣離子通道(VDCCs)和非選擇性陽離子通道(NSCCs)[8,9].由ACh引起的氣管異常收縮也能被白鮮堿劑量依賴性地抑制(圖5)，其最大舒張值為(89.47±3.17)%，收縮被抑制一半時(shí)的濃度(IC50)為(190.11±1.02)%.

當(dāng)使用VDCCs的選擇性抑制劑硝苯地平排除VDCCs對氣管收縮的影響后，白鮮堿依然可以通過劑量依賴地抑制NSCCs來舒張氣管環(huán)(圖6a，6b).硝苯地平抑制VDCCs使氣管平滑肌細(xì)胞中Ca2+濃度降低，產(chǎn)生(11.43±3.73)%的舒張作用.190 μmol·L-1白鮮堿可以舒張余下的(74.68±7.99)%(圖6c,6d).提示了白鮮堿不僅抑制由VDCCs介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，還作用于其他通道，使ACh刺激的氣管環(huán)舒張.

a,b) 排除VDCCs后白鮮堿對ACh預(yù)收縮的氣管環(huán)的量效曲線(n=6);c,d) 白鮮堿對排除VDCCs后的氣管環(huán)的影響(n=6)圖6 排除VDCCs通道后白鮮堿對氣管環(huán)的舒張作用Fig.6 Relaxation effect of dictamnine on tracheal ring without VDCCs

2.5 白鮮堿抑制ACh引起的內(nèi)鈣釋放

在細(xì)胞外無Ca2+的條件下，加入ACh會引起一個(gè)瞬時(shí)收縮，這是由于肌質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，使細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度增加，氣管平滑肌細(xì)胞收縮.當(dāng)細(xì)胞外補(bǔ)充Ca2+后，細(xì)胞外Ca2+流入細(xì)胞質(zhì)，引起一個(gè)持續(xù)穩(wěn)定的收縮，這種收縮可被190 μmol·L-1白鮮堿部分抑制(圖7a).當(dāng)提前孵育190 μmol·L-1白鮮堿時(shí)，由內(nèi)鈣釋放所引起的瞬時(shí)收縮被抑制，而補(bǔ)充細(xì)胞外Ca2+后，外鈣內(nèi)流引起的收縮也被部分抑制(圖7b).當(dāng)排除VDCCs后，190 μmol·L-1白鮮堿對外鈣內(nèi)流引起的持續(xù)穩(wěn)定收縮產(chǎn)生了更大的舒張作用(圖7c).白鮮堿對內(nèi)Ca2+釋放引起的氣管收縮抑制效果與硝苯地平相似(圖7d)，說明白鮮堿可抑制氣管平滑肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放.

a,b) 白鮮堿抑制ACh引起的內(nèi)鈣外流;c,d) 排除VDCCs后白鮮堿對ACh預(yù)收縮的氣管的影響圖7 白鮮堿對ACh引起的內(nèi)鈣釋放的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of dictamnine on the release of intracellular calcium induced by ACh

2.6 白鮮堿抑制Na+/Ca2+交換

除了VDCCs和NSCCs通道之外，Na+/Ca2+交換(NCX)也是調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流的一類重要通道[10].NCX通過作用于膜蛋白并促進(jìn)離子通過膜，產(chǎn)生電壓變化和隨后的去極化來激活信號傳導(dǎo)途徑.在含Na+的正常PSS中，加入100 μmol·L-1ACh會引起氣管持續(xù)穩(wěn)定的收縮，再加入190 μmol·L-1白鮮堿能抑制這種收縮(圖8a).將正常PSS溶液中的Na+用Li+替換掉，氣管的基礎(chǔ)張力有所上升，加入100 μmol·L-1ACh后仍然有一定的收縮，加入190 μmol·L-1白鮮堿后，氣管舒張至基礎(chǔ)張力以下(圖8b).兩組實(shí)驗(yàn)對比，可發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)值、收縮值和舒張值都具有顯著差異，P<0.01.闡明Na+/Ca2+交換在ACh刺激下參與細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的機(jī)制，白鮮堿能抑制Na+/Ca2+交換.

a) 白鮮堿抑制ACh引起的收縮;b) 白鮮堿抑制Na+/Ca2+交換;c) 正常條件下與Na+/Ca2+交換的對比圖圖8 白鮮堿對Na+/Ca2+交換的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of dictamnine on Na+/Ca2+ exchange

2.7 白鮮堿對組織活性的影響

為了研究藥物的刺激對氣管的張力的影響，在白鮮堿抑制氣管舒張后停藥.結(jié)果表明由高鉀再刺激的氣管收縮值可以完全恢復(fù)(圖9a，9b).而由ACh再刺激的氣管收縮值為(54.14±2.62)%，與白鮮堿作用之前相比有明顯差異(圖9c，9d).說明白鮮堿可以舒張預(yù)收縮的氣管，雖然對VDCCs通道無影響，但對ACh激活的其他通道的正常生理活性有影響，也有可能是瞬時(shí)的洗脫藥物不能完全洗掉，因此氣管的再收縮力不及藥物處理之前那么大.

a,b) 白鮮堿對高鉀預(yù)刺激的組織活性的影響; c,d) 白鮮堿對ACh預(yù)刺激的組織活性的影響圖9 白鮮堿對組織活性的影響Fig.9 Effect of dictamnine on tissue activity

3 討論

氣道高反應(yīng)性(AHR)和炎癥是哮喘的關(guān)鍵病理生理學(xué)特征.氣管平滑肌的增強(qiáng)收縮是AHR的原因之一[11].而氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)態(tài)變化發(fā)揮了重大作用[12]，這和質(zhì)膜及肌質(zhì)網(wǎng)上的各種離子通道的活性有關(guān)[13].

在體外常用高鉀溶液和ACh模擬哮喘發(fā)病時(shí)氣管平滑肌痙攣狀態(tài).首先使用高鉀打開氣管平滑肌上的VDCCs通道，引起細(xì)胞外鈣內(nèi)流，氣管平滑肌收縮.結(jié)果表明白鮮堿可以劑量依賴性地抑制VDCCs通道，最大舒張值為(93.72±1.06)%，這依賴于抑制了細(xì)胞外鈣內(nèi)流.而單細(xì)胞離子通道檢驗(yàn)證明白鮮堿完全阻斷VDCCs電流，效果和VDCCs的選擇性抑制劑硝苯地平相似.接著使用ACh打開氣管平滑肌上的VDCCs和NSCCs等離子通道，使氣管平滑肌細(xì)胞去極化，通過細(xì)胞外鈣內(nèi)流和肌質(zhì)網(wǎng)中Ca2+釋放兩方面引起氣管平滑肌收縮[14].結(jié)果表明白鮮堿可以劑量依賴性地抑制ACh引起的氣管收縮，最大舒張值為(89.47±3.17)%，不僅影響Ca2+內(nèi)流還影響肌質(zhì)網(wǎng)中Ca2+釋放.且白鮮堿除了抑制VDCCs通道外，還抑制了其他與Ca2+流入有關(guān)的通道，可能與瞬時(shí)受體電位TRP通道有關(guān)，并對Na+/Ca2+交換(NCX)通道有抑制作用.

白鮮堿具有許多有益的生物活性，如抗血小板聚集，抗高血壓，抗菌，抗有絲分裂，抗真菌，血管舒張等[15].本文實(shí)驗(yàn)證明白鮮堿具有舒張氣管平滑肌異常收縮，擴(kuò)張氣管的作用，有望作為鈣離子拮抗劑抑制氣道高反應(yīng)，緩解哮喘.