夏珍珍，姚家成，黃粵，馮喆，趙新穎，李曉華

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 微生物資源與利用湖北省工程技術(shù)研究中心/生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

尼古丁，又稱煙堿，是一種存在于茄科植物中的天然生物堿[1]，在煙草中含量最為豐富.尼古丁是由一個(gè)吡啶環(huán)和一個(gè)四氫吡咯環(huán)組成的有毒氮雜環(huán)化合物，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易溶于水、乙醇等溶劑，在自然環(huán)境中難以降解.在煙草種植及煙草生產(chǎn)中產(chǎn)生的尼古丁會(huì)隨著雨水滲透到地下，污染水體[2].在吸煙人群中，尼古丁是引起上癮的主要物質(zhì)[3]，長期攝入，對(duì)人體會(huì)造成心腦血管疾病，甚至是致癌、致畸[4,5]等.歐盟標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定尼古丁質(zhì)量濃度超過500 mg·kg-1的煙草廢棄物為“有毒有害物質(zhì)”[6].因此，使用尼古丁降解微生物來降低尼古丁的危害是目前高效率且經(jīng)濟(jì)環(huán)保的方法[7].目前，已發(fā)現(xiàn)及鑒定了很多尼古丁降解菌株，主要是假單胞菌屬(PseudomonasputidaS16[8]、Pseudomonassp. strain HZN6[9])、節(jié)桿菌屬(ArthrobacternicotinoboranpAO1[10])，土壤農(nóng)桿菌屬(Agrobacteriumtumefaciensstrain S33[11])，Shinella屬(Shinellasp. HZN7[12])，中間蒼白桿菌屬(O.intermedium[13])等菌株.

中間蒼白桿菌SCUEC4菌株[14]中的ocnC基因通過測序獲得的核酸序列進(jìn)行在線比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與中間蒼白桿菌SJY1[13]菌株vppC基因和根癌土壤桿菌SCUEC1[15,16]菌株中agnC基因具有同源性，推斷ocnC基因編碼醛脫氫酶，能夠催化4-(6-羥基吡啶-3-基)-4-氧代丁醛轉(zhuǎn)化為6-羥基-3-琥珀酰吡啶[17].本研究對(duì)中間蒼白桿菌SCUEC4菌株中的ocnC基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)異源表達(dá)，對(duì)OcnC蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化，這為闡明中間蒼白菌SCUEC4菌株中完整的尼古代謝途徑、ocnC基因的功能以及醛脫氫酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

EscherichiacoliBL21(DE3) 菌株、原核表達(dá)載體pET28a(+)、中間蒼白桿菌SCUEC4菌株保藏自中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室.

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g·L-1)配方：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸膏5.0 g，氯化鈉10.0 g，加蒸餾水定容到1000 mL，pH 7.0. 固體培養(yǎng)基中添加瓊脂 18.0 g.

1.3 ocnC基因克隆和重組質(zhì)粒pET28a(+)-ocnC的構(gòu)建

使用提取總DNA試劑盒(TaKaRa Mini BEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0)，獲得中間蒼白桿菌SCUEC4菌株總DNA. 根據(jù)中間蒼白桿菌SCUEC4菌株全基因組測序中ocnC基因的核酸序列和質(zhì)粒載體pET28a(+)上的多克隆位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)軟件為Primer Premier 5.0.

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

通過PCR反應(yīng)克隆基因片段.ocnC基因PCR反應(yīng)體系：SCUEC4菌株總DNA 1.0 μL，上游引物Primer-F 1.0 μL，下游引物Primer-R 1.0 μL，MIX (green，擎科金牌)22.0 μL，總體積為25.0 μL.PCR反應(yīng)程序條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃保溫，停止程序.將PCR目的片段回收純化，經(jīng)SacI與Hind III雙酶切后再回收，與同樣雙酶切回收后的載體pET28a(+)使用T4連接酶進(jìn)行連接，將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3).挑取Kan抗性平板中的單菌落，提取質(zhì)粒，再次使用SacI與Hind III雙酶切驗(yàn)證鑒定，將酶切鑒定正確的菌液進(jìn)行DNA測序驗(yàn)證，分析序列結(jié)果.

1.4 ocnC基因的原核表達(dá)與條件優(yōu)化

將測序鑒定正確的pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在25 mL菌液中加入100 mmol·L-1異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.2 mmol·L-1，16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)20 h.將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心，棄上清，收集菌體，加入 4 mL裂解液重懸菌體，超聲破碎 15 min (超聲1 s，間隔 2 s).4 ℃，4000 r·min-1離心10 min，分別收集全菌液、上清液及沉淀.使用12%的分離膠和5%的濃縮膠配方制備的SDS-PAGE凝膠檢測，電壓為90～110 V.

設(shè)置不同的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)ocnC進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以獲得較佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件.在溫度設(shè)置為16 ℃，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為20 h時(shí)，將IPTG終濃度設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1，對(duì)pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE凝膠檢測方法，分析IPTG誘導(dǎo)濃度的較佳條件.在0.2 mmol·L-1IPTG濃度下，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為20 h，將誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置為16、20、25、30、37 ℃，通過SDS-PAGE凝膠檢測方法，分析較佳的誘導(dǎo)溫度條件.在誘導(dǎo)溫度為16 ℃和IPTG濃度為 0.2 mmol·L-1條件下，分別將誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)置為10、15、20、25、30、35、40 h，采用SDS-PAGE凝膠檢測分析表達(dá)量較高的誘導(dǎo)時(shí)間.

1.5 ocnC基因編碼的氨基酸生物信息學(xué)分析

使用NCBI中BLAST在線比對(duì)軟件對(duì)OcnC氨基酸序列檢索，尋找相似度高的氨基酸序列，通過 Clustal X軟件對(duì)OcnC氨基酸序列的同源性進(jìn)行比對(duì)分析.采用MEGA7.0軟件，以N-J法，Bootstrap值為1000，對(duì)OcnC氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，預(yù)測同源序列關(guān)系.使用BioEdit軟件和ExPASy ProtParam在線軟件預(yù)測OcnC氨基酸序列的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；采用PROSITE軟件及NCBI BLASTp在線軟件進(jìn)行氨基酸保守結(jié)構(gòu)域(CD)的預(yù)測；利用Phyre2及 PredictProtein在線預(yù)測蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果與分析

2.1 ocnC基因的克隆與重組質(zhì)粒pET28a(+)-ocnC的構(gòu)建

以中間蒼白桿菌SCUEC4菌株總DNA為模板，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一段大小約為1.3 kb的片段與SCUEC4菌株全基因組測序中ocnC基因大小一致(圖1).

M)DL2000；1) ocnC DNA片段圖1 ocnC PCR基因擴(kuò)增片段Fig.1 PCR amplification of ocnC gene

將PCR擴(kuò)增片段回收純化，雙酶切后與載體 pET28a (+)質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)后，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，使用SacI和Hind III雙酶切驗(yàn)證.通過DNA凝膠結(jié)果分析，質(zhì)粒雙酶切后得到2個(gè)片段，分別對(duì)應(yīng)1.3 kb處的ocnC基因雙酶切片段和5.3 kb處的pET8a(+)質(zhì)粒雙酶切片段(圖2).將驗(yàn)證正確的菌液進(jìn)行DNA序列測定，獲得核酸序列并且與ocnC基因一致.

M1)λ-Hind III DNA；1) pET28a(+)；2) pET28a(+)-ocnC DNA；3) ocnC DNA；M2) DL2000圖2 重組質(zhì)粒pET28a(+)-ocnC的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant plasmid pET28a(+)-ocnC

2.2 OcnC蛋白氨基酸序列分析

利用NCBI BLASTp在線軟件和MEGA7.0軟件，將OcnC蛋白氨基酸序列及其相似度較高的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建OcnC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3).由圖3可知，OcnC蛋白的氨基酸序列與根癌土壤桿菌SCUEC1中的agnC基因具有80.8%的相似度，與Ochrobactrumsp. SJY1 中的醛脫氫酶具有81%的相似性.Ochrobactrumsp. SJY1中的醛脫氫酶能夠催化4-(6-羥基吡啶-3-基)-4-氧代丁醛轉(zhuǎn)化為6-羥基-3-琥珀酰吡啶[13].

根據(jù)ProtParam在線分析蛋白理化性質(zhì)得出：OcnC蛋白含有447個(gè)氨基酸，理論分子量為48.0 kDa，pI為4.99；帶負(fù)電荷(Asp+Glu)和帶正電荷(Arg+Lys)的氨基酸殘基數(shù)分別為57個(gè)和42個(gè)；分子式為C2138H3386N588O645S12；脂肪指數(shù)值為95.06，不穩(wěn)定指數(shù)值為30.39；平均親水系數(shù)值(GRVAY)為0.038. 采用PROSITE、NCBI BLASTp在線對(duì)保守結(jié)構(gòu)域(CD)進(jìn)行預(yù)測，OcnC蛋白屬于醛脫氫酶家族蛋白. 通過Phyre2和 PredictProtein在線預(yù)測OcnC蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋占46.98%，β-折疊占11.63%.

根據(jù)以上理化性質(zhì)的數(shù)值分析，由于OcnC蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)值小于閾值40，可知OcnC蛋白為穩(wěn)定蛋白.由于其帶負(fù)電荷氨基酸數(shù)大于帶正電荷氨基酸數(shù)，可推斷OcnC蛋白為酸性蛋白質(zhì).根據(jù)OcnC蛋白的平均親水系數(shù)值(GRVAY)推測可知，OcnC蛋白屬于疏水性蛋白.利用SignalP 4.1 Server在線軟件，預(yù)測OcnC蛋白中無信號(hào)肽序列，推測OcnC蛋白屬于非分泌性蛋白.

圖3 OcnC蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogetic tree of OcnC protein amino acid sequence

2.3 ocnC基因在大腸桿菌中異源表達(dá)

在16 ℃,0.2 mmol·L-1IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)條件下, 將pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)20 h.分別吸取菌液、沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖4所示.與對(duì)照含pET28a(+)質(zhì)粒E.coliBL21(DE3)菌株對(duì)比，在40.0～55.0 kDa之間有OcnC蛋白的表達(dá). 沉淀中OcnC蛋白濃度較高，上清中OcnC蛋白濃度較少.

M)蛋白Marker；1) 含pET28a(+)質(zhì)粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液；2～4) 含pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒E. coli BL21(DE3)菌株的裂解混合液、上清液和沉淀圖4 E. coli BL21(DE3)中OcnC蛋白的表達(dá)分析Fig.4 Analysis of the OcnC protein expression in E. coliBL21(DE3)

2.4 不同濃度IPTG對(duì)OcnC蛋白表達(dá)量的影響

將IPTG濃度分別設(shè)置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1，對(duì)含pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株于16 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)20 h. SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖5)與含pET28a(+)質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株裂解混合液的對(duì)照組相比，在不同濃度IPTG的誘導(dǎo)條件時(shí)，含pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株裂解混合液，在40.0～55.0 kDa之間有OcnC蛋白的表達(dá)，IPTG濃度在0.2 ～1.0 mmol·L-1范圍內(nèi)，隨著IPTG濃度增加，OcnC蛋白量呈上升趨勢(shì)，在濃度1.0 ～1.2 mmol·L-1范圍內(nèi)，隨著IPTG濃度增加，OcnC蛋白量呈下降趨勢(shì)，表明OcnC蛋白表達(dá)量較高的IPTG濃度為1.0 mmol·L-1.

M)蛋白 Marker；1) 含pET28a(+)質(zhì)粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液；2～7) 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1 IPTG濃度誘導(dǎo)含pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液圖5 OcnC蛋白在不同IPTG濃度表達(dá)量的差異Fig.5 Difference of OcnC protein expression at different IPTG concentrations

2.5 不同誘導(dǎo)表達(dá)溫度對(duì)OcnC蛋白表達(dá)量的影響

在IPTG濃度為0.2 mmol·L-1條件下，將誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置為16、20、25、30、37 ℃.對(duì)含pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)20 h. 通過SDS-PAGE電泳分析結(jié)果，如圖6所示，與含pET28a(+)質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株裂解混合液的對(duì)照組相比，在不同的誘導(dǎo)溫度條件時(shí)，含pET28a(+)-ocnC 重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株裂解混合液，在40.0～55.0 kDa之間有大量OcnC蛋白，在16～37 ℃的誘導(dǎo)溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，OcnC蛋白量逐漸增加，表明OcnC蛋白表達(dá)量較高的溫度在37 ℃.

M)蛋白Marker；1)含pET28a(+)質(zhì)粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液； 2～6)16、 20、 25、 30、 37℃下含pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液圖6 OcnC蛋白在不同誘導(dǎo)溫度表達(dá)量的差異Fig.6 Difference of OcnC protein expression at different induction temperatures

2.6 不同誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)OcnC蛋白表達(dá)量的影響

在16 ℃，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol·L-1的條件時(shí)，分別將誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間設(shè)置為10、15、20、25、30、35、40 h，對(duì)含pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果(圖7)，以含有pET28a(+)質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株為對(duì)照組，在不同的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間中，含pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株，在40.0～55.0 kDa之間存在大量的OcnC蛋白.由圖7可知，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間在10～20 h時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，OcnC蛋白的表達(dá)量在增加；在20～40 h的誘導(dǎo)時(shí)間范圍內(nèi)，OcnC蛋白表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，表明OcnC蛋白表達(dá)量較高的的時(shí)間為20 h.

M) 蛋白Marker；1) 含pET28a(+)質(zhì)粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液；2～8)誘導(dǎo)10、15、20、25、30、35、40 h下含pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒E. coli BL21(DE3)菌株裂解混合液圖7 OcnC蛋白在不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)量的差異Fig.7 Difference of OcnC protein expression at different induction times

3 討論

本研究對(duì)中間蒼白桿菌SCUEC4菌株中與尼古丁降解相關(guān)的ocnC基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，并對(duì)OcnC蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化.以中間蒼白桿菌SCUEC4菌株的總DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到長為1344 bp的基因片段，并對(duì)ocnC基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物學(xué)分析，可知ocnC表達(dá)蛋白大小為48.0 kDa，pI為4.99，OcnC蛋白為非分泌性疏水性蛋白.成功構(gòu)建pET28a(+)-ocnC重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株進(jìn)行異源表達(dá).通過SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)在IPTG濃度為1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)溫度在37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為20 h時(shí)，有較高表達(dá)量的OcnC蛋白，且大部分分布在沉淀中.

將ocnC基因測序結(jié)果在NCBI中比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ocnC基因與中間蒼白桿菌SJYI中的相關(guān)基因相似性有81.1%，ocnC基因核酸序列與本實(shí)驗(yàn)室的根癌土壤桿菌SCUEC1中的agnC基因的核酸序列具有80.8%的相似度.推測ocnC基因編碼的是醛脫氫酶，在醛脫氫酶[18]家族未發(fā)現(xiàn)有100%相似的相關(guān)基因，進(jìn)一步對(duì)OcnC蛋白的結(jié)構(gòu)及功能研究，以增加醛脫氫酶家族的多樣性.

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道預(yù)測的尼古丁降解代謝相關(guān)基因[13,15-17]中，ocnC基因編碼的酶能夠?qū)?-(6-羥基吡啶-3-基)-4-氧代丁醛氧化為6-羥基-3-琥珀酰吡啶，其中6-羥基-假氧化尼古丁通過氧化脫氨基反應(yīng)，生成甲胺和4-(4-羥基苯基)-4-氧代丁醛，6-羥基-3-琥珀酰吡啶可經(jīng)過6-羥基-3-琥珀酰吡啶羥化酶催化單加氧反應(yīng)生成2,5-二羥基吡啶. 由于其代謝途徑中的中間產(chǎn)物沒有被完全發(fā)現(xiàn)，可能還存在著許多其它的尼古丁降解菌及其代謝途徑?jīng)]有被研究.因此，對(duì)于尼古丁降解菌的降解途徑、降解基因以及相關(guān)的酶仍需更加深入的研究.