黃蓉飛 段錦華 樊元春 王曉燕

乳腺癌是女性群體中較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)，其發(fā)病率和死亡率均呈增加趨勢(shì)，嚴(yán)重危害患者健康。及時(shí)診斷和治療是降低患者死亡率的關(guān)鍵措施。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，腫瘤標(biāo)記物已被用于腫瘤的診治和預(yù)后判斷。GATA6是進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞的多種生物學(xué)行為相關(guān)。GATA6在胃癌、膽管癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及患者預(yù)后不良密切相關(guān)[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，GATA6可通過(guò)JAK/信號(hào)通路和調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)參與腫瘤發(fā)展過(guò)程[4]。STAT家族是能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子向細(xì)胞核內(nèi)傳導(dǎo)，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞功能[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT家族重要的成員STAT4與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系也十分密切[8]。但是，GATA6和STAT4在乳腺癌中的作用及機(jī)制還不清楚，本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GATA6和STAT4在乳腺癌中的表達(dá)情況，初步探討二者表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系，以期尋找新的腫瘤標(biāo)志物為乳腺癌的診治和預(yù)后判斷提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2011年1月至2012年12月本院診治的79例乳腺癌患者為研究對(duì)象，均為女性，年齡41～82歲，平均年齡(60.59±6.73)歲。所有乳腺癌患者術(shù)前均未進(jìn)行任何治療，完整的臨床和病理資料完整。其中鱗癌31例，腺癌27例，其他21例；按照不同分化程度分類，高分化18例，中分化36例，低分化25例；按2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，其中Ⅰ期17例，Ⅱ期21例，Ⅲ期19例，Ⅳ期22例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無(wú)轉(zhuǎn)移42例。均行腫瘤切除術(shù)，術(shù)前未進(jìn)行放、化療，術(shù)中留取癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，癌旁組織距離癌組織大于3 cm，經(jīng)病理分析無(wú)癌細(xì)胞。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

GATA6兔抗人多克隆抗體和STAT4兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自上海萬(wàn)疆生物技術(shù)有限公司；通用型SP法免疫檢測(cè)試劑盒夠自武漢默沙克生物科技有限公司；DAB 顯色盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；醫(yī)用微波爐購(gòu)自南京杰全微波設(shè)備有限公司；ZYS-170生物顯微鏡購(gòu)自上海兆儀光電科技有限公司；無(wú)水乙醇、過(guò)氧化氫、枸櫞酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 免疫組化染色與結(jié)果判斷

取乳腺癌癌組織和癌旁組織切片，厚度4 μm，常規(guī)脫蠟處理，梯度乙醇水化，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性氧化酶，微波抗原修復(fù)。清洗后，封閉10 min，滴加一抗，4 ℃孵育12 h。孵育后洗滌，先后滴加生物素標(biāo)記的二抗和辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素，4 ℃各孵育20 min。孵育后PBS洗滌，滴加DAB顯色液染色5 min，之后經(jīng)沖洗、蘇木精復(fù)染、脫水、封片后置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。隨機(jī)挑選切片中的高倍視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量。①按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比計(jì)分為<5%(0分)、5%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)和>75%(4分)。②按染色強(qiáng)度計(jì)分為無(wú)色(0分)、淡黃色(1分)、棕黃色(2分)和棕褐色(3分)。兩項(xiàng)結(jié)果乘積大于3分時(shí)記為陽(yáng)性表達(dá)，否則為陰性表達(dá)。

1.4 隨訪觀察

對(duì)所有乳腺癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為5年，截止至2017年11月，死亡患者以死亡時(shí)間作為隨訪截止期。記錄患者隨訪期間患者的生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用n表示，采用χ2檢驗(yàn)。各組數(shù)據(jù)均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Kaplan-Meier法計(jì)算乳腺癌患者5年存活率，Cox回歸模型分析影響患者預(yù)后因素。

2 結(jié)果

2.1 GATA6和STAT4蛋白表達(dá)情況

癌旁組織中GATA6和STAT4陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.19%、10.13%，乳腺癌組織中GATA6和STAT4陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.56%、62.03%。與癌旁組織相比，乳腺癌組織中GATA6和STAT4陽(yáng)性表達(dá)率均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 GATA6和STAT4表達(dá)情況/例

2.2 GATA6和STAT4在乳腺癌中的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系

在乳腺癌組織中GATA6和STAT4表達(dá)均與腫瘤分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤病理分型無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 GATA6和STAT4相關(guān)性分析

乳腺癌患者中，38例GATA6和STAT4二者均為陽(yáng)性患者，17例GATA6和STAT4二者均為陰性患者，13例GATA6陽(yáng)性STAT4陰性患者，11例GATA6陰性STAT4陽(yáng)性患者。Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，二者在乳腺癌中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(γ=5.613，P<0.05)。結(jié)果如表3所示。

表2 GATA6和STAT4在乳腺癌中的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系/例

表3 GATA6和STAT4在乳腺癌組織中表達(dá)情況/例

2.4 GATA6和STAT4與患者生存率的關(guān)系

采用Kaplan-Meier法分析乳腺癌患者5年存活率，結(jié)果如圖1所示。GATA6和STAT4陽(yáng)性表達(dá)患者5年生存率分別為46.06%、51.02%，GATA6和STAT4陰性表達(dá)患者5年生存率分別為67.86%、73.33%。GATA6和STAT4陽(yáng)性表達(dá)患者5年存活率較對(duì)應(yīng)陰性表達(dá)患者均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A為GATA6表達(dá)對(duì)患者生存期影響，B為STAT4表達(dá)對(duì)患者生存期影響。

2.5 Cox分析影響乳腺癌患者預(yù)后因素

Cox回歸模型分析結(jié)果顯示：GATA6、STAT4、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，見(jiàn)表4。

表4 影響乳腺癌患者預(yù)后因素的Cox分析

3 討論

乳腺癌是女性惡性腫瘤中常見(jiàn)的疾病，中國(guó)乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均逐年上升，已成為當(dāng)前社會(huì)的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。所以，尋找有效的方法提高乳腺癌患者的生存率或存活期尤為重要。目前，主要依據(jù)腫瘤大小、病理組織學(xué)分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況等指標(biāo)判斷乳腺癌的病程以及預(yù)后[9]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究已成為當(dāng)今乳腺癌研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，并取得了一定的成績(jī)。腫瘤標(biāo)記物已被用于腫瘤的診治和預(yù)后判斷。

GATA6是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員，具有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)，能夠識(shí)別GATA序列并與之結(jié)合，在組織發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[10]。GATA6在不同腫瘤組織中的生物學(xué)作用不同，受到越來(lái)越多的關(guān)注。Martinelli等[11]研究發(fā)現(xiàn)，GATA6能間接能抑制上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，間接調(diào)控EMT中涉及的其他轉(zhuǎn)錄因子，在胰腺導(dǎo)管腺癌中起抑癌因子作用。GATA6低表達(dá)的胰腺導(dǎo)管腺癌患者存活期較短，是患者治療療效和預(yù)后判斷的重要參考指標(biāo)。Fantini等[12]研究發(fā)現(xiàn)GATA6參與腸上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和分化，在結(jié)腸癌患者中蛋白陽(yáng)性表達(dá)增加，通過(guò)Wnt /β-catenin途徑發(fā)揮促癌作用。然而，GATA6在乳腺癌中的作用和潛在機(jī)制仍不清楚。本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)乳腺癌組織中GATA6表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GATA6在乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)較癌旁組織升高，且其表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與Song等[13]研究結(jié)果一致，提示GATA6作為促癌因子參與乳腺癌的發(fā)展過(guò)程。GATA6陽(yáng)性表達(dá)患者5年存活率低于陰性表達(dá)患者，是乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示GATA6可作為乳腺癌預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，GATA6可能是STAT4的上游調(diào)控分子。STAT4是 STATs 蛋白家族中的惟一1個(gè)限定組織分布的蛋白，主要分布在淋巴和髓系組織中，由IL-12誘導(dǎo)的反應(yīng)所激活[14]。在IL-12作用下，STAT4誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向分化并產(chǎn)生Th1類細(xì)胞因子IL-2 和IFN-γ，Th1 /Th2 平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切[15]。研究發(fā)現(xiàn)，黃腐酚可能通過(guò)促進(jìn)STAT4的活化，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡向Th1促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫[16]。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，STAT4是卵巢癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，活化的STAT4在卵巢癌的上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并且STAT4過(guò)表達(dá)與卵巢癌患者的不良結(jié)果相關(guān)，可能通過(guò)癌-基質(zhì)相互作用介導(dǎo)EMT過(guò)程，促進(jìn)了卵巢癌的轉(zhuǎn)移。辛彩霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)STAT4在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中的表達(dá)均高于正常肺組織，且與腫瘤分化程度相關(guān)，提示其在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。但是，STAT4在乳腺癌中的表達(dá)是否異常還不清楚。本研究結(jié)果顯示，STAT4在乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率較癌旁組織升高，其高表達(dá)與腫瘤低分化程度、高TNM分期以及淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示STAT4在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程發(fā)揮促癌因子的作用。Cox回歸分析結(jié)果顯示，STAT4是乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，且STAT4陽(yáng)性表達(dá)患者5年存活率較陰性表達(dá)患者低，提示STAT4對(duì)乳腺癌的預(yù)后判斷具有重要參考價(jià)值。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，GATA6和STAT4表達(dá)呈明顯正相關(guān)，兩者與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系具有一致性，GATA6可能通過(guò)STAT4途徑或調(diào)控STAT4共同參與乳腺癌的發(fā)展過(guò)程，有待因一部深入研究。

綜上所述，乳腺癌組織中GATA6和STAT4表達(dá)陽(yáng)性表達(dá)均顯著升高，與腫瘤分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征關(guān)系密切，兩者陽(yáng)性表達(dá)患者存活率均顯著低于陰性表達(dá)患者，是影響乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素，表明其參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，可做為患者預(yù)后判斷的重要參考指標(biāo)。深入研究GATA6和STAT4在乳腺癌中的作用機(jī)制，將會(huì)為乳腺癌的診治提供新的靶點(diǎn)。