李道宏 胡愛俠

結(jié)腸癌(colorectal cance，CRC)發(fā)病率位居常見惡性腫瘤的第三位，盲腸至直腸的任何部位均可發(fā)生[1]。據(jù)報(bào)道[2]，踝蛋白(Talin)和紐蛋白(Vinculin)是與黏著斑相關(guān)的兩個(gè)細(xì)胞骨架蛋白，且在多項(xiàng)研究中證實(shí)對(duì)細(xì)胞的移動(dòng)和浸潤(rùn)具有重要的調(diào)節(jié)作用，目前Talin、Vinculin蛋白表達(dá)與CRC之間的關(guān)系尚未見報(bào)道，因此本研究擬分析 Talin、Vinculin蛋白在CRC組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月至2015年1月我院手術(shù)切除的80例經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為CRC患者的組織標(biāo)本及其癌旁(距癌組織≥5 cm)正常組織標(biāo)本。所有入選患者在術(shù)前均未進(jìn)行放化療和其他治療，且3年隨訪資料完整。80例CRC患者，包括男性患者52例，女性患者28例；年齡25～83歲，平均年齡(48.32±12.23)歲；按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)2009版：Ⅰ+Ⅱ期患者39例，Ⅲ+Ⅳ期患者41例；腫瘤直徑<2 cm患者35例，≥12 cm患者45例；病理類型均為腺癌，組織學(xué)分級(jí)：高分化患者26例，中分化患者32例，低分化患者22例；共有45例發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有組織標(biāo)本均在4%中性福爾馬林液中固定，然后常規(guī)取材石蠟包埋，用于后續(xù)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。CRC患者均以電話、門診等方式進(jìn)行隨訪，總生存時(shí)間(OS)為從手術(shù)至隨訪結(jié)束或者死亡時(shí)間。

1.2 主要抗體和試劑盒

兔抗人Talin多克隆抗體、兔抗人Vinculin單克隆抗體采購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自上海滬峰化工有限公司，鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒采購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)alin、Vinculin蛋白表達(dá)

將石蠟包埋的組織標(biāo)本切成5 μm厚度的切片，放入40%酒精中，40 ℃水浴處理4 min，展開后置于60 ℃烘箱中進(jìn)行烘片。采用二甲苯進(jìn)行脫蠟20 min，然后梯度酒精進(jìn)行水化，然后加入3%雙氧水，室溫10 min，從而阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再對(duì)Talin、Vinculin蛋白進(jìn)行高溫高壓組織修復(fù)，PBS進(jìn)行沖洗，加入5%羊血孵育30 min，除去封閉液，加入一抗，置于4 ℃冰箱過夜，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，次日取出使用PBS沖洗，每張切片滴加二抗，室溫下孵育30 min，PBS沖洗5次，每次3 min，加入DAB顯色水使用PBS沖洗終止顯色，使用水沖洗10 min，鹽酸酒精分化后，梯度酒精脫水干燥，光鏡下觀察組織標(biāo)本。

1.4 Talin、Vinculin蛋白表達(dá)陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)

Talin、vineulin的陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞膜，少量表達(dá)于胞質(zhì)和細(xì)胞外間質(zhì)中，光學(xué)顯微鏡下觀察制備好的切片，陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)呈黃色、棕黃色或黃褐色顆粒。采用雙盲法由兩名病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)在光鏡下觀察，通過染色的強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩個(gè)總分評(píng)分判定是否陽(yáng)性。染色強(qiáng)度：0分為無陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%，1分表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為5%～25%，2分表示含有25%～50%的陽(yáng)性細(xì)胞，3分表示含有50%～75%的陽(yáng)性細(xì)胞，4分表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75%，兩者結(jié)果相乘>3分表示免疫組織化學(xué)陽(yáng)性，≤3為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，分類資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析；等級(jí)變量之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；Kaplan-Meier分析Talin、Vinculin蛋白與CRC患者生存率之間的相關(guān)性；Cox回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析預(yù)后影響因素，以雙側(cè)檢驗(yàn)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Talin、Vinculin蛋白在不同組織中的表達(dá)

Talin和Vinculin在癌旁組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在CRC組織中呈陰性表達(dá)，Talin和Vinculin在CRC組織中表達(dá)率分別為27.50%，21.25%，表達(dá)率均明顯低于癌旁正常組織(77.50%、85.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 Talin、Vinculin在不同組織中的表達(dá)(例，%)

2.2 Talin、Vinculin蛋白表達(dá)與CRC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Talin、Vinculin在不同性別、年齡及腫瘤直徑中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移及TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期病例Talin、Vinculin 表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期病例， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高分化和中分化腺癌Talin、Vinculin表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于低分化腺癌(P<0.05)，見表2。

表2 Talin、Vinculin表達(dá)與CRC臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

2.3 Talin、Vinculin表達(dá)的相關(guān)性分析

58 例Talin表達(dá)陰性病例中Vinculin陰性表達(dá)55 例，22例Talin 表達(dá)陽(yáng)性病例中Vinculin 表達(dá)陽(yáng)性14 例； Spearman 相關(guān)分析顯示，在CRC組織中，Talin和Vinculin表達(dá)之間呈高度正相關(guān)(γ=0.52，P<0.01)，見表3。

表3 Talin、Vinculin在CRC組織中表達(dá)的相關(guān)性

2.4 Talin、Vinculin在CRC組織中的表達(dá)與OS的相關(guān)性

80例患者隨訪3年死亡22例 ，3年生存率為72.50%(22/80)。CRC組織中Talin及Vinculin陽(yáng)性表達(dá)患者3年生存率分別90.91%和94.12%，明顯高于低表達(dá)患者(65.52%，66.67%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1～圖2。

圖1 Talin高表達(dá)及低表達(dá)患者的生存曲線分析

圖2 Vinculin高表達(dá)及低表達(dá)患者的生存曲線分析

2.5 CRC患者預(yù)后影響的 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響3年生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為CRC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而Talin、Vinculin為保護(hù)因素，說明CRC患者Talin、Vinculin表達(dá)越高，患者預(yù)后越好，見表4。

表4 CRC患者預(yù)后影響的 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

3 討論

癌癥已經(jīng)僅次于心血管疾病，成為人類健康的第二大殺手[3]。近年來，隨著人們飲食習(xí)慣與生活方式的改變，CRC的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)，且在發(fā)達(dá)的歐美國(guó)家高于經(jīng)濟(jì)相對(duì)落后的亞非國(guó)家，對(duì)患者的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[4]。目前，CRC的患病機(jī)理尚不清楚，飲食、運(yùn)動(dòng)與肥胖等是眾多環(huán)境致病條件中的主要因素，接近一半的患病誘因可能與膳食結(jié)構(gòu)或營(yíng)養(yǎng)因素有關(guān)[5]。研究表明[6]，有多個(gè)細(xì)胞骨架蛋白參與了CRC的發(fā)生、發(fā)展，深入探討相關(guān)蛋白的表達(dá)有利于進(jìn)一步明確腫瘤的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)可提高臨床分子診斷的準(zhǔn)確性，有助于改善患者預(yù)后。

細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)包括微絲、微管和中間纖維，微絲中含有的微絲結(jié)合蛋白在微絲聚集成束、提高微絲穩(wěn)定性和強(qiáng)度中發(fā)揮重要的作用[7]。膜結(jié)合蛋白是1種微絲結(jié)合蛋白，主要包括結(jié)構(gòu)蛋白(Talin、Vinculin、Tensin等)和調(diào)節(jié)蛋白(FAK、Paxillin 等)，在黏著斑的形成過程中起到關(guān)鍵作用，而在腫瘤細(xì)胞中，由于膜結(jié)合蛋白表達(dá)量降低，導(dǎo)致與膜結(jié)合蛋白相關(guān)的整合素的生物活性發(fā)生改變，不但影響了黏著斑的形成，同時(shí)也阻礙了由整合素介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的信號(hào)傳遞，促進(jìn)了腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[8]。

Talin是1個(gè)含有2541個(gè)氨基酸的細(xì)胞骨架蛋白，是由50 kD的頭部結(jié)構(gòu)域和220 kD桿狀結(jié)構(gòu)域組成的反向平行同源二聚體，Talin是介于actin和整合素之間主要位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面的1種黏著斑成分[9]。研究表明[10]，Talin可以與整合素β亞基的胞漿尾直接相互連接，介導(dǎo)Actin與整合素的結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附能力，對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)起到促進(jìn)作用。據(jù)相關(guān)報(bào)道[11]，成纖維素細(xì)胞和Hela細(xì)胞的應(yīng)力纖維在微注射Talin抗體后發(fā)生改變，細(xì)胞的粘附作用及移動(dòng)功能受到抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)[12]，通過敲除Talin基因老鼠胚胎細(xì)胞在第9天凋亡，這可能是由于Talin缺失改變了原腸胚形成期細(xì)胞的遷移能力導(dǎo)致的。研究發(fā)現(xiàn)[13]，Talin在食管癌組織中的表達(dá)較正常癌旁組織明顯下降。本研究中，CRC組織中Talin的表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，說明Talin可能參與CRC的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步分析顯示CRC組織中Talin隨著TNM分期、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移和分化程度的降低而增加，說明Talin低表達(dá)能夠間接反映CRC惡性生物學(xué)行為。隨訪結(jié)果顯示Talin低表達(dá)患者3年生存率明顯低于高表達(dá)患者，Cox分析結(jié)果顯示Talin高表達(dá)可作為CRC預(yù)后的保護(hù)因素。

Vinculin是與黏著斑有關(guān)的主要細(xì)胞骨架蛋白，包括120 kD和135 kD兩種分子量的亞型[14]。Vinculin蛋白在胞內(nèi)可以通過altin與微絲結(jié)合，再通過與細(xì)胞外表面的整合素分子黏著，發(fā)揮細(xì)胞粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要作用，也是影響細(xì)胞增殖、分化的重要元素[15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，Vinculin蛋白在胞內(nèi)過表達(dá)可使黏著斑更加穩(wěn)定，抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而Vinculin表達(dá)量下調(diào)會(huì)導(dǎo)致整合素與細(xì)胞骨架連接的機(jī)械強(qiáng)度下降，影響?zhàn)ぶ叩纳?，促進(jìn)細(xì)胞的移動(dòng)。所以，Vinculin蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究中，在CRC組織中Vinculin表達(dá)率低于正常組織，提示Vinculin與CRC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切；進(jìn)一步結(jié)果顯示Vinculin與研究的CRC患者臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性與Talin類似，均與TNM分期、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移和分化程度顯著相關(guān)，而與性別、年齡及腫瘤直徑無相關(guān)性；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CRC組織中Talin與Vinculin呈顯著正相關(guān)，提示二者之間存在一定的聯(lián)系，可能是腫瘤組織中內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變后影響指標(biāo)之間的相互表達(dá)；此外，Vinculin低表達(dá)患者3年生存率更低，且Vinculin也可作為CRC患者預(yù)后的保護(hù)因素。

綜上所述，Talin、Vinculin在CRC組織中均呈低表達(dá)，二者可作為CRC患者預(yù)后的保護(hù)因素，此外，Talin、Vinculin與CRC生物學(xué)行為有關(guān)，可能成為CRC診斷的潛在指標(biāo)。