周昌東 楊新平 田玉新 孫 凱 林 洋 張奇夫

膀胱癌是人類泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，當(dāng)前在我國的發(fā)病率、死亡率有逐年增加的趨勢(shì)[1]。泛素樣含PHD和環(huán)指域1(UHRF1)是1個(gè)具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能核蛋白，在生物表觀修飾與維持DNA的甲基化狀態(tài)中發(fā)揮重要作用[2]。UHRF1能通過與抑癌基因的啟動(dòng)子的結(jié)合，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[3-4]。特別是高表達(dá)的UHRF1可以招募組蛋白去乙?；傅教囟ǖ腄NA序列，維持染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[5]。在前列腺癌、肺癌、乳腺癌中對(duì)基因表達(dá)的芯片分析顯示，與正常組織相比，腫瘤組織中UHRF1的表達(dá)顯著升高，且與腫瘤的臨床分級(jí)顯著相關(guān)[6]。轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系-2p45(NF-E2)相關(guān)因子-2(nuclear factor erythroid-2p45-related factor2,Nrf2)及其抑制蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)組成的Keap-1/Nrf2通路在維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原平衡方面發(fā)揮重要作用，并且該信號(hào)通路是一條廣泛存在于多細(xì)胞生物體內(nèi)，并且在進(jìn)化上保持高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7]。Keap-1/Nrf2通路可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，參與腫瘤的惡性進(jìn)展[8]。本文具體分析與探討了UHRF1高表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞Keap-1/Nrf2通路的調(diào)控作用，以明確UHRF1的作用效果與機(jī)制?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

膀胱癌細(xì)胞系UMUC3購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，培養(yǎng)條件：含10%血清的1640培養(yǎng)液，于含5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，一般每3 d按1∶3比例傳代一次，細(xì)胞生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。UHRF1 mimic序列5"-GCCAGAGUGAGUCAGACAATT-3"，對(duì)照mimic序列5"-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3"。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取處于對(duì)數(shù)生長期的UMUC3細(xì)胞，按照2×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine的要求，分別用針對(duì)UHRF1的mimic及對(duì)照mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞，標(biāo)記為A組、B組，同時(shí)以PBS代替轉(zhuǎn)染試劑的為C組，轉(zhuǎn)染后在特定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

取處于對(duì)數(shù)生長期的UMUC3細(xì)胞，接種于96孔板，每孔200 μl，將細(xì)胞濃度控制在1.5×104個(gè)/ml左右。按照1.2的方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后48 h與72 h時(shí)每孔加入MTT 20 μl，37 ℃孵育4 h后在每孔加入150 μl二甲基亞砜，避光反應(yīng)10 min，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔490 nm處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖狀況，細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組]×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

UMUC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，收集細(xì)胞，采用孵育緩沖液洗滌1 次，加入100 μl FITC 標(biāo)記的Annexin Ⅴ緩沖液，避光孵育10 min；棄去后加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液重懸細(xì)胞，避光4 ℃孵育20 min，應(yīng)用雙變量流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用Cell Quest軟件分析并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

取轉(zhuǎn)染后48 h與72 h的細(xì)胞，消化處理成單細(xì)胞懸液，取200 μl細(xì)胞懸液垂直緩慢加入Transwell小室中央，在24孔板下室加入500 μl含血清的1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后取出小室并進(jìn)行固定，用結(jié)晶紫溶液染色后在倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野下的細(xì)胞并取平均值。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

取轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，OD260/OD280結(jié)果在1.8～2.0之間，逆轉(zhuǎn)錄后cDNA后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，總共40 個(gè)循環(huán)，檢測(cè)UHRF1相對(duì)表達(dá)量，GAPDH：正向引物 5"-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3"；反向引物 5"-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3"。UHRF1：正向引物 5"-GGCTCTCAACTGCTTTGCTC-3"；反向引物 5"-TGCTATTCTTGCCACCCTTG-3"。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

取轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，制備好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，采用Western blot檢測(cè)Keap-1、Nrf2、β-actin蛋白表達(dá)情況。

上個(gè)每個(gè)實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量數(shù)據(jù)，對(duì)比方法為獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和ANOV方差檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 UHRF1 mRNA表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，與B組與C組相比，A組UHRF1 mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)UHRF1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況對(duì)比(±s)

表1 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)UHRF1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況對(duì)比(±s)

組別n48h72hA組34.26±0.11①②7.21±0.09①②B組31.09±0.331.02±0.10C組31.12±0.311.00±0.07

注：①為與B組對(duì)比，P<0.05；②為與C組對(duì)比，P<0.05。

2.2 細(xì)胞增殖對(duì)比

轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，與B組與C組相比，A組細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比(±s，%)

表2 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比(±s，%)

組別n48h72hA組33.22±1.29①②2.10±1.11①②B組310.38±3.2914.00±2.10C組311.88±3.2813.76±1.77

注：①為與B組對(duì)比，P<0.05；②為與C組對(duì)比，P<0.05。

2.3 細(xì)胞凋亡對(duì)比

轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，與B組與C組相比，A組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡情況對(duì)比(±s，%)

表3 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡情況對(duì)比(±s，%)

組別n48h72hA組34.44±1.77①②5.44±1.22①②B組316.82±2.1818.32±3.66C組318.88±3.1920.12±2.84

注：①為與B組對(duì)比，P<0.05；②為與C組對(duì)比，P<0.05。

2.4 細(xì)胞侵襲對(duì)比

轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，與B組與C組相比，A組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著增加(P<0.05)。

2.5 蛋白表達(dá)對(duì)比

轉(zhuǎn)染后48 h，與B組與C組相比，A組Keap-1、Nrf2相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，見圖1。

圖1 三組轉(zhuǎn)染后48 h的Keap-1、Nrf2蛋白表達(dá)對(duì)比

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，當(dāng)前隨著隨著我國城市化進(jìn)程的加快，該病的發(fā)病率顯著上升[9]。手術(shù)能提高膀胱癌患者的生存率，但是很多患者在術(shù)后仍出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，為此明確膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制是當(dāng)前研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。人UHRF1在脾臟、胸腺、胚胎肝臟、腎臟和骨髓中大量表達(dá)，也在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)[10]。有研究顯示UHRF1是星型膠質(zhì)瘤中高表達(dá)基因之一，其高表達(dá)與高級(jí)別臨床分期和低分化狀態(tài)顯著相關(guān)，而低表達(dá)UHRF1的星型膠質(zhì)瘤患者生存期顯著長于高表達(dá)患者[11]。同時(shí)在很多惡性腫瘤中，UHRF1也可以作為1種有效的標(biāo)志物，為此表明UHRF1是1種癌基因，高表達(dá)水平的UHRF1使細(xì)胞處于增殖旺盛的狀態(tài)，并抑制細(xì)胞的凋亡[12]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，與B組與C組相比，A組的細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率顯著降低，細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著增加。基礎(chǔ)研究也顯示高表UHRF1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制UHRF1可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；UHRF1過表達(dá)后，可以通過接觸細(xì)胞的接觸抑制，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖；同時(shí)抑制UHRF1的基因表達(dá)能降低肺癌細(xì)胞侵襲能力[13]。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖的平衡維持著機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，UHRF1可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的凋亡[14]。同時(shí)UHRF1表達(dá)水平與白血病的的存活細(xì)胞率呈劑量依賴性下降，抑制UHRF1的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡發(fā)生；UHRF1不僅能抑制抑癌基因Rb1的表達(dá)，也能結(jié)合Rb1基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，從而能調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15]。

UHRF1含有18個(gè)外顯子，其編碼基因位于染色體19p13.3上，括其N-端的UBL結(jié)構(gòu)、C-末端的RING結(jié)構(gòu)域、串聯(lián)的Tudor結(jié)構(gòu)域、PHD結(jié)構(gòu)域、SRA結(jié)構(gòu)域[16]。UHRF1可能是連接蛋白酶體與組蛋白翻譯后修飾之間的分子橋梁，特別是PHD結(jié)構(gòu)域與SRA結(jié)構(gòu)域的作用是使UHRF1 與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1結(jié)合，進(jìn)而使DNA 發(fā)生甲基化[17]。免疫組化研究顯示UHRF1的表達(dá)水平與血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子、雌激素受體、P53無關(guān)，而與HER-2的陽性表達(dá)顯著相關(guān)。氧化應(yīng)激是多種高度活化的分子對(duì)脂類、DNA、蛋白造成損傷的細(xì)胞毒性過程，氧化應(yīng)激反應(yīng)可造成胞內(nèi)活性氧大量釋放[18]。Nrf2長期以來被認(rèn)為是1種保護(hù)性的因子，正常生理狀態(tài)下Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)中并處于低水平表達(dá)狀態(tài)[19]。在Nrf2誘導(dǎo)劑信號(hào)刺激下，可解除Nrf2的泛素化降解，激活Nrf2的表達(dá)，并進(jìn)一步識(shí)別和結(jié)合氧化反應(yīng)元件上特定的DNA序列，參與調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白和下游Ⅱ相代謝酶基因的調(diào)控和表達(dá)[20]。當(dāng)誘導(dǎo)解除后，Keap-1因子會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核重新與Nrf2結(jié)合，并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)，使Nrf2的表達(dá)處于低水平。還有研究顯示在胃癌中發(fā)現(xiàn)了Nrf2的氨基序列發(fā)生體細(xì)胞突變，從而導(dǎo)致Nrf2在核內(nèi)累積，從而調(diào)控下游調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[21]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后48 h，與B組與C組相比，A組的Keap-1、Nrf2相對(duì)表達(dá)量顯著增加，表明高表達(dá)UHRF1能促進(jìn)Keap-1/Nrf2通路的激活。Nrf2能夠上調(diào)多種葡萄糖代謝酶，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xL的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。同時(shí)敲除Nrf2基因的小鼠能夠降低癌基因的表達(dá)，降低癌癥發(fā)生率。并且Keap-1/Nrf2通路與其他信號(hào)通路存在著大量的交互作用，可能通過各種交互作用共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和增殖。不過本研究也存在一定的缺陷，UHRF1的具體作用機(jī)制還不太明確，對(duì)Keap-1/Nrf2通路的影響闡述還不夠深入，將在下一步的研究中進(jìn)行深入分析。

綜上分析，UHRF1高表達(dá)能激活膀胱癌細(xì)胞Keap-1/Nrf2通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖與侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。