李 睿 龔 琳 李 庚 潘國(guó)慶

目前,成人幽門螺桿菌(helicopter pylori,H.pylori)的感染率在世界范圍內(nèi)已超過(guò)50%，在我國(guó)幽門螺桿菌感染率更高達(dá)80%[1-2]。潘等[3]研究表明，MMP-9的表達(dá)能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，其與胃癌的預(yù)后相關(guān)。本研究擬采用不同濃度的H.pylori感染胃癌細(xì)胞，利用Western-blot實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)胃癌細(xì)胞中MMP-9、p-ERK1/2和t-ERK1/2表達(dá)的變化水平，再進(jìn)一步利用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),觀察H.pylori對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響，來(lái)探究H.pylori與胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力改變的分子機(jī)制，為胃癌中根治H.pylori提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細(xì)胞株SGC7901購(gòu)自于上?？吕咨锟萍加邢薰荆挥拈T螺桿菌26695菌株(ATCC 26695國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株)購(gòu)自于美國(guó)ATCC；胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；Ham's F12和RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；鏈青霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，基質(zhì)膠購(gòu)自于美國(guó)BD生物科技有限公司，MMP-9抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，ERK/p-ERK抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，GADPH購(gòu)自于美國(guó)Sigma Aldrich公司，24孔Transwell室購(gòu)自于美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞及細(xì)菌共培養(yǎng) 使用Ham's F12培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3天后傳代。幽門螺桿菌26695國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株種植于含5%無(wú)菌脫纖維羊血、且經(jīng)過(guò)高壓滅菌的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，于微需氧培養(yǎng)罐中，使用微需氧產(chǎn)氣袋，置于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后自然冷卻至50 ℃時(shí)添加脫纖維羊血及多粘菌素B(250 U/L)，萬(wàn)古霉素(6 mg/l)，兩性霉素(2 mg/l)，TMP(5 mg/l)，混勻后澆板。將長(zhǎng)成菌落的H.pylori懸浮于含3%胎牛血清的Ham's F12培養(yǎng)基中，測(cè)定OD660值，1 OD660=1×108菌落形成單位(CFU)。按胃癌細(xì)胞與幽門螺桿菌菌落之比為1∶0、1∶50、1∶100共培養(yǎng)12 h；按胃癌細(xì)胞與幽門螺桿菌菌落之比為1∶100，與SGC7901共培養(yǎng)0、12、24 h。再用PBS清洗5次，收集細(xì)胞并提取蛋白。

1.2.2 Western-blot 使用RIPA裂解液將待測(cè)蛋白調(diào)整至相同濃度待用。將等量蛋白加入到10%濃度SDS-PAGE膠上樣孔中，電泳120 min后用半干轉(zhuǎn)移法恒流轉(zhuǎn)移，60 min后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5% BSA的TBST室溫封閉1.5 h，再按照分子量剪下膜與抗MMP-9及GADPH抗體進(jìn)行孵育，4 ℃過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后TBST洗3次，每次10 min。接著在室溫下與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，孵育結(jié)束后TBST洗3次，每次10 min。去掉多余的TBST后在膜上滴加ECL發(fā)光液發(fā)光，于數(shù)碼凝膠分析系統(tǒng)(天能)采集曝光數(shù)據(jù)，用Image J圖形處理軟件分析目標(biāo)條帶。

1.2.3 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)不處理組按1∶8比例用無(wú)血清Ham's F12培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠，混勻后吸取100 μl添加到Transwell小室中，37 ℃溫箱成膠1 h后取出，于下室添加500 μl含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基，上室加入無(wú)血清F12培養(yǎng)基重懸的SGC7901細(xì)胞，放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。36 h后取出。無(wú)菌棉簽拭去小室上層的細(xì)胞，2%多聚甲醛固定小室下層5 min。PBS清洗后蘇木精染色5 min，再次PBS清洗。高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。處理組加入無(wú)血清Ham's F12培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠時(shí)，再加入ERK抑制劑U0126，孵育4 h后，其余步驟同不處理組。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 幽門螺桿菌對(duì)胃癌細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的影響

與h.pylori 共培養(yǎng)24 h之后，胃癌細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)量隨胃癌細(xì)胞與h.pylori菌數(shù)比例的增加而增加(圖1)。

圖1 MMP-9在SGC7901中表達(dá)情況

2.2 H.pylori對(duì)胃癌細(xì)胞p-Erk1/2、t-Erk1/2表達(dá)的影響

如圖2所示，與h.pylori共培養(yǎng)之后胃癌細(xì)胞中p-Erk1/2的表達(dá)量也隨胃癌細(xì)胞與h.pylori比例的增加而增加，而t-Erk1/2的表達(dá)變化不明顯。

圖2 p-Erk1/2、t-Erk1/2在SGC7901中表達(dá)情況

2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不處理組中，隨著胃癌細(xì)胞與H.pylori比例的增加,穿透基膜的胃癌細(xì)胞數(shù)目增加,各組穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而加入ERK抑制劑U1206的處理組中，穿透基膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，各組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3 胃癌細(xì)胞侵襲情況

3 討論

H.pylori感染與人體慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌、粘膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。幽口螺桿茵作為細(xì)菌性致癌物，是胃癌最主要的致癌因素之一，但其潛在的致癌機(jī)制還尚不完全清楚。胃癌是起源于胃黏膜上皮的消化道惡性腫瘤，在我國(guó)胃癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的第四位，死亡率占惡性腫瘤的第二位[5]，而死亡率高的主要原因又與胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的生物學(xué)特征，也是胃癌患者復(fù)發(fā)及死亡的主要原因[6]。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是1個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，腫瘤細(xì)胞依靠?jī)?nèi)皮靶點(diǎn)和基底膜進(jìn)行繼發(fā)性侵襲[7]。目前的文獻(xiàn)[8]表明MMPs可介入腫瘤的產(chǎn)生、侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制，其中MMP-9是MMPs中降解基底膜主要成分Ⅳ型膠原蛋白最主要的酶，它還可通過(guò)破壞局部組織結(jié)構(gòu)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤新血管形成而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胃癌等[9-11]中，MMP-9的過(guò)表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

為了探究H.pylori是否是通過(guò)MMP-9 而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，本研究中，把胃癌細(xì)胞和H.pylori按1∶0、1∶50、1∶100的比例共同培養(yǎng)，Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MMP-9的表達(dá)量增加了。說(shuō)明h.pylori可能是通過(guò)影響胃癌細(xì)胞中MMP-9的表達(dá),而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

同時(shí)，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用也至關(guān)重要[7]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括MAPK激酶激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK，是連接細(xì)胞外與細(xì)胞核之間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，其磷酸化形式激活后共同參與體內(nèi)多種生理或病理過(guò)程的調(diào)節(jié)過(guò)程。其中，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)是MAPKs家族中的一個(gè)亞族，磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)是ERK1/2 磷酸化后的活性形式，通過(guò)從胞漿向胞核傳遞信號(hào)，參與細(xì)胞增殖分化等調(diào)節(jié)作用[12]。有文獻(xiàn)[13]報(bào)道，在肺癌中激活ERK1/2，能使腫瘤細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。ERK1/2 的活化異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程有關(guān)[14]。而ERK1/2信號(hào)通路將通過(guò)磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子如激活蛋白1(AP-1)，Elk-1 等，其中 AP-1 位于基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)基因啟動(dòng)子區(qū)域，持續(xù)的ERK1/2通路活化將上調(diào)MMPs表達(dá)，導(dǎo)致重要的蛋白水解酶MMP-2等含量增加，使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分解增強(qiáng)而導(dǎo)致腫瘤侵襲、遷移的發(fā)生[15-16]。因此，ERK1/2 及 MMPs 是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17]。

為了探究H.pylori促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制是否是通過(guò)ERK1/2通路，Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)隨著H.pylori比例的增加而顯著增多。為了進(jìn)一步研究，我們進(jìn)行了Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，不處理組是不同比例H.pylori感染的胃癌細(xì)胞，處理組是加入ERK抑制劑劑U0126的不同比例H.pylori感染的胃癌細(xì)胞，分別測(cè)定各組細(xì)胞的侵襲力。結(jié)果表明，未處理組的細(xì)胞穿透基膜的數(shù)目隨著H.pylori比例的增加而增多。而處理組的細(xì)胞穿透基膜的數(shù)目卻明顯減少了，各組穿透基膜的數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示H.pylori感染可能通過(guò)ERK1/2-MMP-9信號(hào)通路發(fā)揮作用，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞侵襲能力。

綜上所述，H.pylori感染和胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其中幽門螺桿菌感染可通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，從而在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，此發(fā)現(xiàn)可有助于在胃癌的臨床診療過(guò)程中找到可靠有效的治療靶點(diǎn)。本研究中初步揭示了H.pylori可通過(guò)ERK1/2-MMP-9信號(hào)通路，調(diào)控胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移，為胃癌的治療提供了新思路。