張 杰,李 喬,郭文娜,許曉蒙,孫發(fā)鑫,許 卉

(煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺 264005)

炎癥是指接受刺激后機(jī)體產(chǎn)生的一系列反應(yīng),其誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥細(xì)胞因子并激發(fā)機(jī)體進(jìn)行防御反應(yīng)[1]．當(dāng)巨噬細(xì)胞受到細(xì)菌脂多糖(LPS)持續(xù)刺激,能夠分泌大量炎癥細(xì)胞因子[2],如腫瘤壞死因子-α(TNF-α),一氧化氮(NO),白細(xì)胞介素8(IL-8),白細(xì)胞介素6(IL-6)等一系列活性物質(zhì),通過調(diào)節(jié)這些致炎因子表達(dá),是實(shí)現(xiàn)抑制炎癥反應(yīng)的重要途徑[3-6]．

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,廣譜抗菌藥阿奇霉素(AZM)[7],能有效治療常見敏感菌所致的呼吸道疾病、皮膚及軟組織感染等疾病,對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、支原體等致病菌均有較強(qiáng)抗菌活性[8],查閱相關(guān)文獻(xiàn),大量數(shù)據(jù)證明阿奇霉素具免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用,可以降低TNF-α、IL-6、NF-κB、IL-8和MMP-2活性[9]．

不同藥物聯(lián)合可發(fā)揮協(xié)同或疊加作用,發(fā)揮各自優(yōu)勢,顯著提高療效,降低副作用[10]．臨床研究表明,阿奇霉素廣泛聯(lián)用多種清熱解毒類中藥制劑,在治療感染性疾病方面具有良好的臨床療效[11]．苦木注射液(KM)為小眾中藥注射液,方劑是由苦木干燥枝或莖經(jīng)加工制成的橙黃色的澄明液體注射液,有清熱、解毒、消炎的功效,主要用于感冒、上呼吸道感染、急性扁桃體炎、腸炎、細(xì)菌性痢疾等[12]．進(jìn)行臨床用藥調(diào)查,目前尚未見苦木注射液與化學(xué)抗生素類藥物聯(lián)用的臨床報道．

本研究以LPS刺激 RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建體外炎癥模型,TNF-α和NO作為炎性檢測指標(biāo),探究了阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液體外抗炎作用,為拓寬苦木注射液的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

酶標(biāo)儀(DNM-9602 MICROPLATE READER),CKX31型倒置顯微鏡(菲律賓奧林巴士公司),恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),程序凍存盒,超凈臺．

苦木注射液(江西青峰藥業(yè)有限公司),批號:2016072303,規(guī)格:2 mL;阿奇霉素注射液(山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司),批號:518013152,規(guī)格:0.25 g;RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清(Gibco公司);小鼠TNF-α ELISA試劑盒(晶美生物有限公司);LPS、MTT(Sigma公司)．其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 阿奇霉素注射液及苦木注射液均以生理鹽水稀釋制備(終濃度10～300 μg/mL),4 ℃冷藏備用．

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 正常小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW246.7細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(ATCC)),用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)．約1～2 d傳代1次．

1.2.3 MTT檢測 取RAW264.7細(xì)胞懸液200 μL,每孔接種密度為1×104個/孔,于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h,分別加入LPS(終濃度1 μg/mL)及不同濃度阿奇霉素(終濃度10～300 μg/mL)與苦木注射液(終濃度10～300 μg/mL),各組均平行設(shè)置3個孔,同時設(shè)LPS組、空白對照組、單藥組、聯(lián)合用藥組,培養(yǎng)24 h后于每孔均分別加入20 μL MTT(終濃度500 μg/mL),培養(yǎng)4 h棄去上清加入DMSO150 μL,振搖至藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解,以630 nm為參比波長,用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度A570,進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)．細(xì)胞生長抑制率公式如下:

細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A570/空白對照組平均A570)×100%.

1.2.4 NO濃度測定 取RAW246.7細(xì)胞懸液200 μL,每孔接種密度為5×105個/孔,各組均平行設(shè)置3個孔．培養(yǎng)1 h后分別加入LPS(終濃度1 μg/mL)及不同濃度的阿奇霉素(25、50、100 μg/mL)與苦木注射液(12.5、25、50、100、200 μg/mL),同時設(shè) LPS組、空白對照組、單藥組、聯(lián)合用藥組,培養(yǎng)24 h,分別吸取上清100μL,加入相同體積Griess試劑(Griess試劑A:1 g/L N-萘乙二胺鹽酸鹽;Griess試劑B:體積分?jǐn)?shù)為5%的H3PO4,10 g/L對氨基苯磺酰胺．使用前等體積混合),充分反應(yīng)后測定A540．配制不同濃度NaNO2溶液0、10、20、40、60、80、100 μmol/L,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將吸光度代入標(biāo)曲計算公式,求算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO-2濃度．依據(jù)NO抑制率公式,計算單藥組及聯(lián)合用藥組對NO抑制率．吸取上清后,進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),操作步驟如上述所示．進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn).

NO抑制率=([NO]LPS-[NO]LPS+Sample/[NO]LPS-[NO]BLK)×100%.

1.2.5 ELISA法測定上清中TNF-α濃度 取RAW246.7細(xì)胞懸液200 μL,每孔接種密度為2×105個/孔,各組均平行設(shè)置3個孔．培養(yǎng)1 h,分別加入LPS(終濃度1 μg/mL)及不同濃度的阿奇霉素(25、50、100 μg/mL)與苦木注射液(12.5、25、50、100、200 μg/mL),同時設(shè)LPS組、空白對照組、單藥組、聯(lián)合用藥組,置培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)4h后收集上清液,按照TNF-α ELISA試劑盒說明書方法步驟進(jìn)行系列測定,進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn).依據(jù)相應(yīng)A450值及標(biāo)準(zhǔn)液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)標(biāo)曲公式計算單藥組及聯(lián)合用藥組TNF-α濃度．

1.2.6Q值評價組合效果 研究苦木注射液聯(lián)合阿奇霉素抗炎相互作用,基于金正均法[13](在Burgi氏公式法的基礎(chǔ)上,分析了其缺點(diǎn)并進(jìn)行修正得出,也稱概率相加法),計算組合指數(shù)Q值．基于該理論,組合效應(yīng)可以定量地定義為相加作用,Q=0.85～1.15;協(xié)同作用,Q≥1.15;拮抗作用,Q≤0.85．Q值可以通過以下公式計算:

其中,E(A+B)為兩藥合用抑制率,EA為A藥單獨(dú)給藥抑制率,EB為B藥單獨(dú)給藥抑制率.

2 結(jié) 果

2.1 阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液對巨噬細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)A570值計算得出阿奇霉素單藥組(10～300 μg/mL)、苦木注射液單藥組(10～300 μg/mL)及LPS組細(xì)胞存活率均大于90%．最高濃度配比苦木注射液(終濃度200 μg/mL)與阿奇霉素(100 μg/mL)聯(lián)合對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞孵育24h后的細(xì)胞存活率大于90%,如圖1所示．可以看出,經(jīng)LPS刺激后,RAW264.7細(xì)胞的存活率未明顯改變(P>0.05);單藥組及聯(lián)合用藥組的細(xì)胞存活率也沒有降低(P>0.05)．巨噬細(xì)胞的存活率均大于85%,單藥組及聯(lián)合用藥組均不抑制RAW264.7細(xì)胞的正常增殖．

圖1阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞存活率影響

Fig. 1 Effect of azithromycin combined with Kumu injection on the survival rate of RAW264.7 cells stimulated by LPS

2.2 阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液對NO的影響

檢測空白組細(xì)胞上清中NO,測定濃度非常低,僅為0.98 μmol/L,在1 μg/mL的LPS刺激下,巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放大量NO(16.8 μmol/L),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩組間有顯著性差異(P<0.01),表明LPS能顯誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)NO．與LPS組相比,苦木注射液單藥組作用的RAW264.7細(xì)胞上清液中,一氧化氮的含量明顯減少,隨著用藥濃度增高NO的濃度逐漸降低,呈現(xiàn)良好劑量依賴關(guān)系;阿奇霉素單藥組與LPS組相比,NO含量未顯著減少,隨著用藥濃度的增高NO的濃度未逐漸降低,并未呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,如圖2所示．

圖2阿奇霉素及苦木注射液單藥組不同濃度釋放NO的濃度

Fig.2 Concentration of NO released by different concentrations of azithromycin and Kumu injection

阿奇霉素與苦木注射液不同聯(lián)用配比(1∶1、2∶1、1∶2)釋放NO濃度如圖3所示．與LPS組相比,3種不同聯(lián)用配比的聯(lián)合用藥組作用的RAW264.7細(xì)胞上清液中,NO含量均明顯減少,隨著用藥濃度的增高NO的濃度逐漸降低,均呈現(xiàn)出良好劑量依賴關(guān)系;比較3種不同聯(lián)用配比釋放的NO濃度,阿奇霉素與苦木注射液在聯(lián)用配比2∶1下釋放NO濃度較其他2組相對較低,聯(lián)用配比1∶2時對NO的抑制作用最強(qiáng)．

Fig. 3 The concentration of NO released by a combination of azithromycin and Kumu injection

綜合圖2、圖3，比較阿奇霉素及苦木注射液單藥組、聯(lián)合用藥組對NO釋放的影響．聯(lián)合用藥組與單藥組相比,聯(lián)合用藥組釋放NO的濃度明顯低于單藥組,兩藥聯(lián)合使用后對NO的抑制效果均優(yōu)于單藥組(P<0.05)．

2.3 苦木注射液及阿奇霉素對TNF-α的影響

在1 μg/mL LPS刺激下,巨噬細(xì)胞釋放出大量的TNF-α,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示空白組與LPS組間有顯著性差異(P<0.01),表明LPS能顯著誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)TNF-α．與LPS組相比,單藥組及聯(lián)合用藥組,TNF-α含量均明顯減少,隨著用藥濃度的增高TNF-α濃度逐漸降低,呈現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系．如圖4所示．

與LPS組相比,聯(lián)合用藥組作用的RAW264.7細(xì)胞上清液中,TNF-α含量均明顯減少,隨著用藥濃度的增高TNF-α的濃度逐漸降低,均呈現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系;比較不同聯(lián)用配比對TNF-α的抑制作用,聯(lián)合用藥配比2∶1時對TNF-α的抑制作用相對較弱;聯(lián)合用藥配比1∶1及1∶2均對TNF-α有相對較強(qiáng)的抑制作用,且此2種配比對TNF-α抑制率未有顯著性差異．如圖5所示．

Fig.4 Effect of azithromycin and Kumu injection on TNF-α re-lease alone

Fig.5 Effect of azithromycin-Kumu injection on TNF-α release

由圖4、圖5可知，聯(lián)合用藥組與單藥組相比,聯(lián)合用藥組TNF-α濃度明顯低于單藥組TNF-α濃度,兩藥聯(lián)合使用后對TNF-α的抑制效果均優(yōu)于單藥組(P<0.05)．

2.4 藥效學(xué)相互作用

根據(jù)金正均法計算組合指數(shù)Q值,基于該理論,計算得出阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液對炎癥因子NO具相加抑制作用(Q=0.85～1.15),對炎癥因子TNF-α具協(xié)同抑制作用(Q>1.15)．Q值計算結(jié)果如表5所示．

表5 聯(lián)合用藥組Q值計算結(jié)果

3 討 論

阿奇霉素在臨床上廣泛使用,其耐藥性是臨床應(yīng)用的最大健康威脅之一.為應(yīng)對阿奇霉素耐藥性,藥物聯(lián)合現(xiàn)象日漸普遍,聯(lián)合治療可有效增強(qiáng)阿奇霉素療效．作為后抗生素時代的替代藥物,中藥可有效延緩、消除細(xì)菌耐藥作用,中藥制劑在臨床上廣泛與包括阿奇霉素在內(nèi)的抗生素聯(lián)用．阿奇霉素在臨床廣泛與清熱解毒類中藥制劑(如喜炎平注射液、痰熱清注射液、熱毒寧注射液等)聯(lián)合應(yīng)用,臨床治療效果評價較高,苦木注射液作為一小眾清熱解毒類中藥制劑,目前尚未見阿奇霉素與其進(jìn)行聯(lián)用的臨床報道．

本實(shí)驗(yàn)以LPS刺激RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α、NO作為炎性指標(biāo),研究表明阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液較單藥組相比對炎癥因子TNF-α、NO均具明顯的抑制作用,聯(lián)合用藥具更顯著體外抗炎效果,本次實(shí)驗(yàn)僅考察了TNF-α、NO 2種炎性指標(biāo),IL-6,NF-κB,IL-8等炎癥指標(biāo)仍有待進(jìn)一步研究以期提高實(shí)驗(yàn)的可靠性、系統(tǒng)性．

4 結(jié) 論

本研究以炎癥因子TNF-α、NO作為評價指標(biāo),以阿奇霉素聯(lián)合苦木注射液對炎癥因子TNF-α、NO的抑制作用進(jìn)行了考察,最終確定對TNF-α、NO均具有明顯的抑制作用,體外抗炎效果明顯．為拓寬苦木注射液的臨床應(yīng)用提供了可靠的依據(jù)．