李篤軍，馮漸燾,劉真真，劉入華，賈 楠，陳海霞，趙 輝，朱元祺*

(1.煙臺業(yè)達醫(yī)院 檢驗科，山東 煙臺264006；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科，山東 青島266555；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島266071)

目前，無論是國內(nèi)還是國外耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)，都顯示對碳青酶烯類耐藥的腸桿菌以克雷伯菌屬為主[1,8]。其中，克雷伯菌屬中又以肺炎克雷伯菌居多，而產(chǎn)酸克雷伯菌報道相對較少。與肺炎克雷伯菌一樣，產(chǎn)酸克雷伯菌可引起人體的呼吸、血流、腹腔和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染[1，2]。因此，我們對2013年9月-2013年12月分離自新生兒患者的3株碳青霉烯類耐藥的產(chǎn)酸克雷伯菌的耐藥機制和菌株間的同源性進行研究，為臨床治療和采取感控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株3株碳青霉烯類耐藥產(chǎn)酸克雷伯菌(TJ11-TJ13)是2013年9月-2013年12月分離自新生兒患者的吸痰液。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC700324和大腸埃希菌ATCC25922及接合試驗受體菌EscherichiacoliJ53AziR為本室保存。臨床株的鑒定和藥敏使用VITEK 2 Compact系統(tǒng)，藥敏依據(jù)CLSI-2018標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果[3]。醫(yī)院感染的診斷依據(jù)患兒的臨床資料和 “醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(2001年試行)[4]進行。

1.2 設(shè)備與試劑PCR擴增儀和脈沖場電泳儀為美國伯樂公司；脈沖場凝膠電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)為英格蘭Biolabs公司；DNA的地高辛標(biāo)記試劑為羅氏公司；其他試劑和材料為大連寶生(TaKaRa)生物。

1.3 耐藥基因的擴增依據(jù)參考文獻[5]方法擴增β-內(nèi)酰胺酶及其他耐藥相關(guān)基因，并通過產(chǎn)物測序確定基因型。生工生物(上海)工程有限公司完成引物合成和產(chǎn)物測序。

1.4 脈沖場凝膠電泳和多位點序列分型脈沖場凝膠電泳(PFGE)依據(jù)相關(guān)文獻操作，結(jié)果判斷依據(jù)Tenover規(guī)則[6]。多位點序列分型(MLST)參照產(chǎn)酸克雷伯菌網(wǎng)站提供管家基因的引物序列和反應(yīng)條件進行 (https://pubmlst.org/koxytoca)。

1.5 質(zhì)粒接合和分型供體菌(產(chǎn)酸克雷伯菌)與受體菌(EscherichiacoliJ53AziR)接合試驗和質(zhì)粒復(fù)制子分型(PBRT )按相關(guān)文獻操作[5]。

1.6 S1核酸酶切質(zhì)粒和Southern雜交S1核酸酶酶切質(zhì)粒的脈沖場凝膠電泳和Southern雜交實驗按以前文獻報道的方法[5]。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)酸克雷伯菌和接合子的藥敏及耐藥基因結(jié)果

菌株藥敏顯示這3株產(chǎn)酸克雷伯菌除了對氨基糖苷類、喹諾酮類和氨曲南敏感外，對測試的β-內(nèi)酰胺類抗生素都耐藥。另外，供體菌(產(chǎn)酸克雷伯菌TJ11-TJ13)與受體菌(EscherichiacoliJ53AziR)經(jīng)液相接合獲得了接合子(TJC11-TJC13)。PCR擴增和測序表明產(chǎn)酸克雷伯菌與其接合子都攜帶blaNDM-1、blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4和aac(6′)-Ib-cr耐藥基因，且二者顯示相似的耐藥表型。但是，接合子(TJC11-TJC13)比受體菌(EscherichiacoliJ53AziR)對β-內(nèi)酰胺類抗生素明顯耐藥。詳見表1-表2。

表1 產(chǎn)酸克雷伯菌臨床株、接合子和受體菌的藥敏(μg/mL)

表2 產(chǎn)酸克雷伯菌與其接合子攜帶的耐藥基因和接合子的質(zhì)粒分型

2.2 產(chǎn)酸克雷伯菌的脈沖場凝膠電泳和多位點序列分型結(jié)果

3株產(chǎn)酸克雷伯菌之間的脈沖場凝膠電泳條帶數(shù)目及位置相同，且多位點序列都屬于ST2型。此外，依據(jù)醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，引起患兒的感染都屬于醫(yī)院感染。因此，依據(jù)臨床資料、菌株分離時間、脈沖場凝膠電泳和多位點序列實驗結(jié)果，表明攜帶blaNDM-1基因ST2型產(chǎn)酸克雷伯菌在新生兒中存在醫(yī)院感染的克隆聚集流行。結(jié)果詳見圖1和表2。

注：M，lambda ladder PFGE marker ；Lane 1-3，產(chǎn)酸克雷伯菌TJ11-TJ13

圖1 XbaI酶切產(chǎn)酸克雷伯菌基因組PFGE圖

2.3 質(zhì)粒的S1核酸酶切、Southern雜交和復(fù)制子分型結(jié)果

S1核酸酶切和Southern雜交顯示產(chǎn)酸克雷伯菌攜帶大小約100 kb和275 kb兩個質(zhì)粒，而接合子僅攜帶約275 kb質(zhì)粒，且兩者攜帶的blaNDM-1基因都位于275 kb 的質(zhì)粒上。另外，基于PCR的質(zhì)粒復(fù)制子分型表明接合子攜帶IncHIB型質(zhì)粒。詳見圖2。

3 討論

近幾年來，由于碳青霉烯類抗菌藥物暴露的增加和/或不合理的應(yīng)用，全國許多省市對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌的分離率明顯增加[1]，甚至有的地區(qū)碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯桿菌分離率超過30%，這使臨床治療面臨很大的困難[1,7]。產(chǎn)酸克雷伯菌與肺炎克雷伯菌一樣，對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制是產(chǎn)碳青霉烯酶，并可引起人體多部位的感染[7]。

注：圖(A)：M，lambda ladder PFGE marker；Lane 1，S1核酸酶切的產(chǎn)酸克雷伯菌TJ11；Lane 2，S1核酸酶切的接合子TJC11；圖(B)：Lane 3，產(chǎn)酸克雷伯菌TJ11的 Southern雜交；Lane 4，接合子TJC11的Southern雜交

圖2 質(zhì)粒的S1核酸酶切PFGE和Southern雜交圖

在編碼產(chǎn)碳青霉烯酶的產(chǎn)酸肺炎克雷伯菌中，目前已報道的有VIM-1[8],VIM-2[9]，VIM-4[10]，KPC-2[7，11,12]、NDM-1[12]和IMP[7,12,13]等基因型。西班牙學(xué)者Pérez的一項研究[8]顯示，在80株碳青霉烯類耐藥的產(chǎn)酸克雷伯菌中，60% (48/80) 為VIM-1型,37.5% (30/80) 為OXA-48,3.7% (30/80) 為 KPC-2,2.5% (30/80) 為KPC-3,僅1.2% (30/80)屬于NDM-1型基因。國內(nèi)徐小紅等報道[7]，在5株耐碳青霉烯類產(chǎn)酸克雷伯菌中，僅有兩株分別檢出IMP-4，KPC-2和IMP-8。但是，我們研究表明這3株產(chǎn)酸克雷伯菌均攜帶blaNDM-1基因，同時還攜帶多個其他耐藥基因，如blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4和aac(6′)-Ib-cr耐藥基因。Pérez的研究還顯示，碳青霉烯酶耐藥基因位于IncL,IncHI2,IncFII,IncN,IncC和 IncP6型質(zhì)粒上，而本研究的blaNDM-1基因位于大小約275 kb的IncHIB型質(zhì)粒上。另外，在Pérez的研究中，12株經(jīng)全基因組測序的產(chǎn)酸克雷伯菌顯示大部分菌株的多位點序列為ST2型，這一點本文研究與其相一致。

對于碳青酶烯類耐藥產(chǎn)酸克雷伯菌，國內(nèi)外報道往往這些菌對其他類抗生素也同時耐藥[7,8]。但是，這3株產(chǎn)酸克雷伯菌除了對大部分β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥外，呈現(xiàn)出對氨基糖苷類、喹諾酮類敏感的藥敏表型,具體原因可能與各個地區(qū)差異等因素有關(guān)，有待進一步研究。

產(chǎn)酸克雷伯菌無論是對碳青霉烯類耐藥株還是敏感株，都可引起成人或新生兒的醫(yī)院感染暴發(fā)[14,15]。導(dǎo)致暴發(fā)的原因除了患者自身的因素外，常與侵入性操作或周圍環(huán)境污染定植等因素有關(guān)。國內(nèi)韓志偉報道[16]一起由產(chǎn)酸克雷伯菌引起中心靜脈置管后菌血癥的感染。Lowe則報道由于洗手池污染產(chǎn)超光譜β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)酸克雷伯菌而導(dǎo)致的醫(yī)院感染暴發(fā)[16]。由于本研究是回顧性，未能找到引起克隆聚集的具體原因。

總之，我們的研究表明，對碳青酶烯類耐藥的ST2型產(chǎn)酸克雷伯菌的耐藥機制是與其攜帶blaNDM-1、blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4和aac(6′)-Ib-cr耐藥基因有關(guān)，而且在2013年9月-2013年12月期間，新生兒中存在該克隆株的播散。因此，要引起臨床重視，并加強各個環(huán)節(jié)的感控制措施。