呂建蘭 胡勁濤 柴 樂(lè) 錢(qián)劍勝 任偉凡 全仁夫

急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）可導(dǎo)致?lián)p傷平面以下各種運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和神經(jīng)功能障礙，是一種嚴(yán)重的中樞系統(tǒng)損傷，其治療是世界性臨床醫(yī)學(xué)難題[1-2]。本研究應(yīng)用改良Allen’s 法[3]制備大鼠急性不完全脊髓損傷模型，探討抑制高遷移率組蛋白（high mobility group box-1 protein，HMGB1）對(duì)大鼠ASCI 炎癥反應(yīng)的影響，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 清潔級(jí)雄性Wister 大鼠32 只，體質(zhì)量（150±20）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005]，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SPF）分籠飼養(yǎng)，每籠4只，溫度20～24℃，濕度50%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 HMGB1 抑制劑甘草酸干粉1g/瓶（MB6641，大連美侖生物技術(shù)有限公司，大連）、RIPA 裂解液（普利萊基因技術(shù)有限公司，北京）、HMGB1 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（E181174）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-Kbp65）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（E181213）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（E189043）、白介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（E190068）、白介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（E189705）（均購(gòu)自Assay 公司，美國(guó)）、TaKaRa 試劑盒（RR047A，Invitrogen 公司，美國(guó)）、Trizol 試劑（15596026，Invitrogen 公司，美國(guó)）；10g 克氏針（江蘇金鹿醫(yī)療器械公司，ZX105），勻漿器（江蘇金偉實(shí)驗(yàn)儀器），Bio-Tek ELX800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo Scientific Varioskan Flash），Step one plus PCR 儀（ABl，美國(guó)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 脊髓損傷模型建立 應(yīng)用改良Allen's 法制備急性不完全性脊髓損傷模型大鼠，實(shí)驗(yàn)順序隨機(jī)進(jìn)行。大鼠稱重后用3%戊巴比妥鈉（1.5mL/kg）[4]腹腔注射麻醉，待大鼠無(wú)四肢反應(yīng)后將其俯臥于操作臺(tái)上，取背部T9-T11 正中切口，鈍性分離椎旁肌肉，咬除T10 棘突及全部椎管，暴露0.5cm 寬硬膜，用自制的改良打擊裝置（質(zhì)量為10g 的克氏針沿帶有刻度的透明管從60mm 高處垂直自由下落，致傷量為60g/cm）造成脊髓中度損傷，使大鼠出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)、擺尾反射，致傷后迅速移開(kāi)打擊物，逐層縫合切口，大鼠出現(xiàn)雙下肢遲緩性癱瘓，運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分（BBB）評(píng)分<2 分，證明造模成功[5-6]。術(shù)后每天注射青霉素80U 預(yù)防感染，連用3 天；每天2 次人工膀胱按摩協(xié)助排尿。

2.2 分組及給藥 選擇健康雄性Wister 大鼠32只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、模型組、甘草酸組，每組8 只。假手術(shù)組大鼠只咬除T10 棘突和椎板，不損傷脊髓；模型組和甘草酸組大鼠按上述造模法損傷脊髓，模型組大鼠術(shù)后正常飼養(yǎng)，不做其它處理，甘草酸組大鼠術(shù)后給予甘草酸（溶于生理鹽水，200mg/kg）灌胃處理，每天1 次，連用3 天[7]，實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)大鼠死亡。術(shù)后3 天，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1.5mL/kg），待動(dòng)物麻醉后于冰上迅速剪取以傷段為中心上下各0.5cm 節(jié)段脊髓組織存入-80°冰箱，用于ELISA 檢測(cè)和qRT-PCR 檢測(cè)。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.3.1 ELISA 檢測(cè)大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 及IL-1β 表達(dá)量 按照大鼠HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用生物素雙抗夾心技術(shù)檢測(cè)脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)步驟：準(zhǔn)備試劑（生物素標(biāo)記的抗HMGB1抗體、抗NF-κB 抗體、抗TNF-α 抗體、抗IL-6 抗體、抗IL-1β 抗體、鏈霉親和素-HRP），將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋；加入準(zhǔn)備好的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)1h；洗板5 次，加入顯色液A、B，37℃避光顯色10min；加入終止液終止反應(yīng)；10min內(nèi)讀取各孔的吸光度（OD 值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液的檢測(cè)結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各組樣品的實(shí)際濃度。

2.3.2 qRT-PCR 法檢測(cè)大鼠脊髓組織HMGB1、NFκB、TNF-α、IL-6 及IL-1β mRNA 表達(dá)量 采用Trizol 法分組提取總RNA，檢測(cè)RNA 濃度及純度。按照TaKaRa 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以待檢測(cè)基因的引物為模板，采用Step one plus PCR 儀進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，以β-actin 作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量分析。大鼠脊髓損傷區(qū)HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 引物序列由上海生工生物技術(shù)合成提供。HMGB1：上游5'-ATGGGC-AAAGGAGATCCTA-3'，下游5'-ATTCTCATCATCT-CTTCT-3'；NFκB：上游5'-CGATCTGTTTCCCCTC-ATCT-3'，下游5'-ATTGGGTGCGTCTTAGTGGT-3'；TNF-α：上游5'-CCAACAAGGAGGAGAAGTTCC-3'，下游5'-CTCTGCTTGGTGGTTTGCTAC-3'；IL-6：上游5'-CTACGAAGAACTGGCAATATG-3'，下游5'-AAACCATCTGGCTAGGTAAGA-3'；IL-1β：上游5'-GACTTCACCATGGAACCCGT-3'，下游5'-GGAGACTGCCCATTCTCGAC-3'；β-actin：上游5'-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3'，下游5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，正態(tài)資料采用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD 法（方差齊）或Tunnett T3 法（方差不齊），非正態(tài)資料采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)量比較 ELISA 結(jié)果顯示，脊髓損傷大鼠的HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平較未脊髓損傷大鼠高（P 均＜0.01）；脊髓損傷后，甘草酸灌胃處理大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNFα、IL-6、IL-1β 水平較模型組低（P 均＜0.01）。見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 表達(dá)量比較 qRT-PCR 結(jié)果顯示，脊髓損傷大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNFα、IL-6 和IL-1β mRNA 表達(dá)水平較未脊髓損傷大鼠高（P 均＜0.01）；脊髓損傷后，甘草酸灌胃處理大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 表達(dá)水平較模型組低（P 均＜0.05）。見(jiàn)表2。

4 討論

ASCI 的病理過(guò)程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷是由強(qiáng)大外力導(dǎo)致的初次損傷，包括壓迫和挫裂傷。繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，機(jī)體隨后出現(xiàn)的一系列病理、生化反應(yīng)，主要包括炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等。脊髓原發(fā)性損傷后隨之而來(lái)的繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致殘余神經(jīng)通路受損和功能喪失的重要原因，炎性反應(yīng)是繼發(fā)性脊髓損傷微環(huán)境改變的主要成分，在ASCI 的病理生理學(xué)機(jī)制中處于中心地位，但對(duì)于是何種分子啟動(dòng)了ASCI 后的炎性反應(yīng)仍有待研究[8-9]。

表1 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB 及相關(guān)炎性因子水平比較（pg/mL，）

表1 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB 及相關(guān)炎性因子水平比較（pg/mL，）

注：正常組和假手術(shù)組無(wú)脊髓損傷；模型組和甘草酸組有脊髓損傷，甘草酸組在脊髓損傷后予甘草酸灌胃處理，模型組無(wú)特殊處理；HMGB1 為抑制高遷移率組蛋白；NF-κB 為核轉(zhuǎn)錄因子κB；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；IL-1β 為白介素-1β；與正常組、假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

表2 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB 及相關(guān)炎性因子mRNA 表達(dá)量比較（×10-3，）

表2 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB 及相關(guān)炎性因子mRNA 表達(dá)量比較（×10-3，）

注：正常組和假手術(shù)組無(wú)脊髓損傷；模型組和甘草酸組有脊髓損傷，甘草酸組在脊髓損傷后予甘草酸灌胃處理，模型組無(wú)特殊處理；HMGB1 為抑制高遷移率組蛋白；NF-κB 為核轉(zhuǎn)錄因子κB；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；IL-1β 為白介素-1β；與正常組、假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

HMGB1 作為一類高度保守的DNA 結(jié)合蛋白，穩(wěn)定存在于正常組織細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)受到損傷、炎癥等理化因素刺激后，組織細(xì)胞缺血缺氧，大量的HMGB1可被動(dòng)/主動(dòng)的釋放至細(xì)胞外，與神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的表面受體結(jié)合，即可啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，通過(guò)誘導(dǎo)TNF-α 及IL-6，在炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[10-11]。

NF-κB 幾乎存在于脊髓組織所有的細(xì)胞中，其最主要的功能是調(diào)控炎性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。脊髓損傷致細(xì)胞受刺激后，通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路的活化引起ASCI 后炎性反應(yīng)以及繼發(fā)性神經(jīng)損害，TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子都受NF-κB 的調(diào)控[12-14]。ASCI 后的局部缺血、低氧等應(yīng)激因素導(dǎo)致IKB 的磷酸化，引起NF-κB 活化，激活NF-κB 信號(hào)通路，通過(guò)上調(diào)編碼炎癥相關(guān)因子基因的表達(dá)，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，增加炎性介質(zhì)的合成和釋放，而這些炎性介質(zhì)又反過(guò)來(lái)激活NF-κB 信號(hào)通路，形成的細(xì)胞外正反饋調(diào)節(jié)，可放大炎癥效應(yīng)，加重ASCI 后神經(jīng)損傷[15]。HMGB1 依賴性的NF-κB 信號(hào)通路可能參與脊髓損傷后的炎性反應(yīng)。HMGB1 作為危險(xiǎn)信號(hào)分子及炎癥介質(zhì)，可以介導(dǎo)一系列重要的生物學(xué)功能，包括觸發(fā)炎癥、以及促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、凋亡等過(guò)程[16-17]?，F(xiàn)研究表明，甘草酸可抑制細(xì)胞內(nèi)HMGB1的釋放和細(xì)胞外HMGB1 活性，對(duì)神經(jīng)起重要保護(hù)作用，Kim 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸可通過(guò)抑制HMGB1分泌而發(fā)揮抗炎作用，對(duì)腦神經(jīng)具有保護(hù)作用。Gu等[19-20]也發(fā)現(xiàn)甘草酸的抗炎作用可減輕大鼠缺血性脊髓損傷和腦缺血再灌注損傷。

炎性反應(yīng)是造成ASCI 后不可逆損害的重要病理基礎(chǔ)之一。HMGB1 及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，在脊髓損傷后繼發(fā)的炎癥、凋亡及神經(jīng)功能恢復(fù)中起著重要作用，HMGB1 是改善脊髓損傷后神經(jīng)功能的新穎治療靶點(diǎn)[21]。本實(shí)驗(yàn)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ASCI 后3 天，受損脊髓組織HMGB1 表達(dá)出現(xiàn)峰值，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，給甘草酸組大鼠行甘草酸灌胃處理，通過(guò)ELISA 和RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組和甘草酸組大鼠，由于脊髓遭受急性損傷，脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白及其mRNA 表達(dá)量較正常組和假手術(shù)組明顯增加；但是，在脊髓損傷后使用甘草酸，大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白水平及其mRNA 表達(dá)量較未使用甘草酸的模型組降低。我們推測(cè)HMGB1 至少部分參與介導(dǎo)ASCI 的炎性反應(yīng),并與HMGB1 依賴的NF-κB 信號(hào)通路密切相關(guān)。