陳江飛，楊建坤，黃慧宇，余有本，王偉東

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

茶樹[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]作為一種葉用經(jīng)濟(jì)作物，在中國乃至世界范圍具有廣泛的栽培種植。然而，茶樹在其生長發(fā)育過程中經(jīng)常面臨著各種環(huán)境脅迫的影響，如冬季和早春的低溫脅迫、夏季的高溫和干旱脅迫，以及土壤鹽漬化引起的高鹽脅迫等。因此，明確茶樹脅迫響應(yīng)機(jī)制，篩選和鑒定抗性基因?qū)ε嘤剐圆铇鋬?yōu)良品種具有重要意義。

眾所周知，己糖(六碳糖，如葡萄糖和果糖)是植物中大多數(shù)代謝途徑和有機(jī)物質(zhì)合成的原始底物，其在參與糖酵解、呼吸作用、物質(zhì)合成和分解代謝前需進(jìn)行磷酸化，而己糖激酶(Hexokinase，HXK)是催化己糖磷酸化的關(guān)鍵酶之一[1]。目前，越來越多的研究證實HKX不僅具有催化己糖磷酸化的作用，其還參與植物糖感受和糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[2]。例如，擬南芥AtHXK1和AtHXK2反義轉(zhuǎn)基因植株對外源葡萄糖的敏感性顯著降低，而過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對外源葡萄糖高度敏感[3]；進(jìn)一步的研究表明，擬南芥AtHXK1通過感知葡萄糖水平，從而參與細(xì)胞增殖、根和花序生長、葉片膨脹和衰老以及葉片蒸騰等植物生長發(fā)育過程[4-6]。另外，植物HXK可以把葉綠體生成的糖信號傳導(dǎo)到細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)光合作用有關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物的光合作用，同時己糖激酶在質(zhì)體-細(xì)胞核的信號傳導(dǎo)中也有著至關(guān)重要的用途[7]。此外，許多研究證實HXK參與了植物對各種生物和非生物脅迫的響應(yīng)過程。例如，NbHXK1、 AtHXK1和AtHXK2參與了甲基紫精和病原體感染誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[8]；低溫、滲透和鹽脅迫能夠顯著誘導(dǎo)擬南芥AtHXK2的表達(dá)，而抑制情況AtHXK3的表達(dá)[9-10]；過表達(dá)的水稻OsHXK5或OsHXK6能夠顯著抑制植株生長，其可能依賴于對光合基因RBCS的抑制作用[11]；類似地，AtHXK1在保衛(wèi)細(xì)胞中的過表達(dá)促進(jìn)了氣孔的關(guān)閉，進(jìn)而降低了糖處理下植株的蒸騰作用[6]；HXK1通過氧化磷酸化調(diào)控水稻OsCIPK15基因的表達(dá)參與缺氧信號途徑[12]。然而，茶樹中有關(guān)NXK的研究相對滯后，其參與茶樹脅迫響應(yīng)的功能機(jī)制尚不清楚。

本試驗從茶樹中克隆獲得了CsHXK1基因cDNA序列，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析了該基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征，并利用實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)分析了CsHXK1在高溫、干旱、低溫及鹽脅迫下的表達(dá)模式，以期為探討該基因逆境脅迫下的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，為茶樹抗逆分子遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

以長勢一致的‘龍井長葉’品種茶樹穴盤扦插苗為試驗材料，于人工氣候箱中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。2周后，分別對茶苗進(jìn)行高溫(40 ℃)、低溫(4 ℃)、鹽脅迫(200 mmol/L NaCl)和干旱脅迫(20% PEG 6000)處理，其他條件保持不變。每個處理設(shè)置3次重復(fù)，并于處理后0、2、6、12、24和48 h分別取0.1 g嫩葉；此外，取未處理茶苗的根、嫩莖、嫩葉以及花器官用于組織表達(dá)分析，所有樣品用液氮速凍并置于-80 ℃保存，備用。

1.2 茶樹總RNA提取和cDNA合成

茶樹葉片材料的總RNA采用CTAB法進(jìn)行提取，用NanoDrop 2000c(Thermo Scientific，美國)對RNA的濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測，再經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABM，加拿大)合成cDNA用于基因的克隆及熒光定量PCR反應(yīng)。

1.3 茶樹 CsHXK1基因的克隆

根據(jù)茶樹基因組[13]中CsHXK1基因序列設(shè)計特異性全長引物(F：GAATCGATCTCTGAGCCTGTGATGG，R：CTGAATACTTGGCCTTTGACCAT)，以‘龍井長葉’品種茶樹cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的條帶，回收產(chǎn)物連接至pMD19-T 載體(TaKaRa，大連)進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用ProtParam tool在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白理化性質(zhì)；ProtScale(http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)進(jìn)行親/疏水性分析；Netphos 3.0 Serve(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)預(yù)測蛋白質(zhì)磷酸化位點；用軟件DNAMAN8 進(jìn)行多序列比對，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；用在線軟件WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位，采用SignaIP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線軟件進(jìn)行信號肽預(yù)測。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

根據(jù)基因序列設(shè)計定量引物(F：CAGAATATGATCAAGCATTGGAT，R：TATGAGGGGTCCTTAAAATAAATGG)，以茶樹CsPTB基因為內(nèi)參基因(F：TGACCAAGCACACTCCACACTATCG，R：TGCCCCCTTATCATCATCCACAA)，參照SYBR○RPremix ExTaqⅡ(TaKaRa，大連)試劑盒說明進(jìn)行qRT-PCR分析，反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min 30 s，循環(huán) 40次；60 ℃ 30 s，71 個循環(huán)，每次上升0.5 ℃。每個樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT算法分析[14]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010和SPSS 22軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹 CsHXK1基因的克隆

以茶樹‘龍井長葉’葉片的cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得特異性單一條帶(圖1)，測序結(jié)果顯示該條帶序列全長1 534 bp，包含一個1 488 bp的開放閱讀框，編碼495個氨基酸，與茶樹基因組中序列一致為茶樹CsHXK1基因cDNA序列。此外，基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示茶樹CsHXK1基因由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成(圖2)。

M. DL2000; 1-2：PCR產(chǎn)物 PCR amplification product

圖1 茶樹CsHXK1基因cDNA全長序列RT-PCR擴(kuò)增
Fig.1 RT-PCR amplification of the full-length cDNAofCsHXK1gene in tea plant

2.2 茶樹CsHXK1蛋白多序列比對與進(jìn)化分析

多序列比對結(jié)果顯示，茶樹CsHXK1蛋白與其他物種的HXK1蛋白具有較高的相似性，且均包含2個磷酸化作用位點：phosphate 1和phosphate 2、一個底物結(jié)合位點sugar binding和一個ATP結(jié)合位點(圖3)。進(jìn)化分析顯示，茶樹CsHXK1蛋白與擬南芥AtHXK1、蘋果MdHXK1和甘藍(lán)BoHXK1的進(jìn)化關(guān)系較近，而與單子葉植物水稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

圖2 茶樹 CsHXK1基因的結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structural analysis of CsHXK1 gene in tea plant

2.3 茶樹CsHXK1蛋白生物信息學(xué)分析

2.3.1 茶樹CsHXK1蛋白理化性質(zhì)分析 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測顯示，茶樹CsHXK1蛋白分子式為C2379H3816N652O709S23，其蛋白分子質(zhì)量為53.63 ku，理論等電點為5.96，含有負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)62個，正電荷殘基(Arg+Lys)54個。疏水性分析結(jié)果顯示CsHXK1蛋白的親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，且GRAVY指數(shù)為-0.002，表明其屬于親水性蛋白(圖5)。

實線框為磷酸化位點 The solid line frame is the phosphorylation site；虛線框為ATP結(jié)合位點 The dotted line frame is the ATP binding site；下劃線為底物結(jié)合位點 The underline is the substrate binding site

圖3 茶樹與其他植物HXK1蛋白的多序列比對
Fig.3 Multiple sequence alignment of HXK1 from tea plant and other plants

2.3.2 茶樹CsHXK1蛋白磷酸化分析 磷酸化位點預(yù)測分析顯示，CsHXK1蛋白包含多個磷酸化位點，其中以絲氨酸位點居多，推測其可能受到磷酸化的調(diào)控作用(圖6)。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示CsHXK1蛋白主要定位與葉綠體和細(xì)胞核中；此外，SignalP軟件預(yù)測顯示在CsHXK蛋白的第54～55位氨基酸處存在信號肽。

圖4 不同物種的HXK1蛋白進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of HXK1 protein sequences from different species

圖5 茶樹CsHXK1蛋白疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of CsHXK1 protein

圖6 茶樹CsHXK1蛋白磷酸化位點分析Fig.6 Analysis of phosphorylation site of CsHXK1 protein

2.4 茶樹 CsHXK1基因啟動子順式作用元件 分析

利用PLACE軟件對CsHXK1基因上游啟動子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CsHXK1基因啟動子區(qū)域含有與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，如脫落酸響應(yīng)元件ABRE、機(jī)械損傷響應(yīng)元件Wun-motif、脫水響應(yīng)元件ACGTATERD1和低溫響應(yīng)元件MYBCORE等，還包含多個與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和糖信號轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)的順式作用元件，如TGACG-motif和MYCCONSENSUSAT等 (表1)。

2.5 茶樹 CsHXK1在不同組織中的表達(dá)分析

如圖7所示，CsHXK1基因在各個組織中都能被檢測，且呈現(xiàn)出一定的組織表達(dá)特異性，其在茶樹的花器官中表達(dá)量最高，其次是葉片，根和莖中最低。

2.6 非生物脅迫下茶樹 CsHXK1基因表達(dá)模式分析

qRT-PCR結(jié)果顯示，在不同脅迫處理下茶樹CsHXK1基因均被誘導(dǎo)表達(dá)，但其表達(dá)趨勢存在明顯差異(圖8)。其中，CsHXK1的表達(dá)水平在高溫處理的前12 h快速升高，且在第12 h達(dá)到峰值，約為對照的10倍左右，之后其表達(dá)量急速回落到對照水平；而20% PEG 6000模擬干旱處理下，CsHXK1基因表達(dá)水平逐步上升，在第 48 h達(dá)到對照的6～7倍，但在12 h時有輕微的降低；在低溫處理下，CsHXK1在第2 h受誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，并在第12 h達(dá)到表達(dá)峰值，后期逐漸回落；CsHXK1在鹽處理下一直維持較高的表達(dá)水平。

表1 茶樹 CsHXK1基因啟動子區(qū)域重要順式作用元件分析Table 1 Analysis of important cis-acting regulatory elements in the upstream regulatory sequence of CsHXK1

圖7 茶樹 CsHXK1基因在不同 組織中的表達(dá)分析Fig.7 Analysis of expression of CsHXK1 gene in different tissues

3 討 論

HXK蛋白不僅能夠催化己糖磷酸化，為植物的生命活動提供能量保證，而且在糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及逆境響應(yīng)方面也具有重要的生物學(xué)功能。目前，有關(guān)于HXK蛋白的研究已經(jīng)成為廣泛關(guān)注的熱點[15-16]。

目前，擬南芥中鑒定有6個HXK成員，其中AtHXK1.2、AtHXK1.3、AtHXL1和AtHXL2基因包含9個外顯子和8個內(nèi)含子[2]；Cho等[17]發(fā)現(xiàn)除了水稻OsHXK1之外，絕大多數(shù)的OsHXK含有相同數(shù)量的外顯子和內(nèi)含子。同時， Guo等[18]證實基因的內(nèi)含子數(shù)目與長度對基因的表達(dá)具有重要影響。本研究中筆者也發(fā)現(xiàn)茶樹CsHXK1基因由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成，這與小立碗蘚[19]和蘋果[20]HXK的研究結(jié)果一致，表明單、雙子葉植物的HXK1基因的結(jié)構(gòu)均高度保守，推測其發(fā)揮著類似的生物學(xué)功能。另外，信號肽預(yù)測顯示茶樹CsHXK1蛋白在N端具有信號肽，這暗示CsHXK1可能是分泌性蛋白，其在信號肽的作用下，運(yùn)輸?shù)街更c地點后對其目標(biāo)底物進(jìn)行磷酸化作用[20]。前人的研究指出，植物HXK蛋白在細(xì)胞中的定位具有明顯的不同，如擬南芥AtHXL2和AtHXL3定位于線粒體膜上[2]，煙草HXK蛋白則定位于葉綠體[21]，還有一些單子葉植物如水稻玉米的HXK蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[21]，且不同的亞細(xì)胞定位也導(dǎo)致其功能上的差異[22]。筆者預(yù)測發(fā)現(xiàn)茶樹CsHXK1蛋白主要定位于葉綠體和細(xì)胞核中，結(jié)合Cho等[11]研究認(rèn)為細(xì)胞核內(nèi)的HXK蛋白能夠與VHA-B1和RPT5B結(jié)合成復(fù)合體，并作用于葡萄糖信號調(diào)節(jié)基因的啟動子，以此調(diào)控目的基因的表達(dá)；而定位于葉綠體中的HXK在功能上主要是對葉綠體中的己糖進(jìn)行磷酸化[19，23]，推測茶樹CsHXK1蛋白可能在葉綠體和細(xì)胞核中也具有相類似的功能，然而這需要進(jìn)一步試驗驗證。

圖8 茶樹 CsHXK1基因的表達(dá)模式分析Fig.8 Analysis of expression pattern of CsHXK1 gene in tea plant

許多研究表明，HXK基因在植物不同組織間的表達(dá)水平有較大差異，對植物的生長發(fā)育起到不同的調(diào)控作用[2，17]。例如，甘薯IbHXK1在成熟的塊莖中表達(dá)較高，參與對淀粉的酵解過程[24]；水稻多數(shù)HXK在水稻的未成熟的種子、莖、葉片、花中均有表達(dá)，而OsHXK10僅在花中被檢測到[2]；蘋果MdHXK1則主要在花中表達(dá)，并與花瓣中花青素的積累密切相關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)茶樹CsHXK1也在葉片和花中有較高的表達(dá)，表明其可能在上述組織器官中發(fā)揮重要作用。此外，大量研究已證實HXK廣泛參與植物非生物脅迫響應(yīng)過程，例如過表達(dá)擬南芥AtHXK1和AtHXK2能夠明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對氧化脅迫的耐受性[8]；擬南芥AtHXK2受到干旱、鹽和低溫的顯著誘導(dǎo)，而高溫、干旱等逆境也會提升AtHXKL3的轉(zhuǎn)錄水平[9]；在水稻和向日葵中，一些HXK的同源基因也不同程度的受非生物脅迫的誘導(dǎo)[25-26]。最近，趙錦等[20]發(fā)現(xiàn)蘋果MdHXK1除了受到鹽、低溫及外源ABA的顯著誘導(dǎo)，還發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域包含多個與逆境響應(yīng)的相關(guān)元件。本研究亦發(fā)現(xiàn)茶樹CsHXK1基因啟動子區(qū)域含有多個逆境響應(yīng)元件，如ABA響應(yīng)元件、脫水響應(yīng)元件及低溫響應(yīng)元件，這可能與其響應(yīng)逆境脅迫具有密切的聯(lián)系。同時，qRT-PCR結(jié)果也表明茶樹CsHXK1受到高溫、干旱、低溫及鹽脅迫的顯著誘導(dǎo)，這與Li等[27]的結(jié)果高度一致，意味著CsHXK1參與到多種非生物脅迫響應(yīng)過程中。本研究為進(jìn)一步探究茶樹CsHXK1在非生物脅迫響應(yīng)過程中的功能提供了重要的前期參考。