李 蘭， 賈 錚， 肖志明， 索德成， 劉志英， 郭紅雙， 徐思遠(yuǎn)， 田 靜， 樊 霞

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京），北京100081；2.中牧股份有限公司，北京100070）

沸石是一簇架狀結(jié)構(gòu)的含水硅酸鹽礦物（李日強(qiáng)等，2008）， 構(gòu)成其骨架的最基本結(jié)構(gòu)是硅氧（SiO4四面體和鋁氧AlO4）四面體。 沸石構(gòu)架中有發(fā)達(dá)的孔穴、 孔道并具有色散力和靜電力兩種作用力，故具有較強(qiáng)的吸附性。 同時(shí)天然沸石因骨架中含有可交換的陽(yáng)離子而具有離子交換樹脂特性（張英俊等，2008）。維生素B1在預(yù)混合飼料中極易受到各種因素如水分、溫度、微量元素、氯化膽堿等的影響而降解（單安山，2001）。 利用沸石的這一性質(zhì)，可將維生素B1吸附于框架中，以達(dá)到穩(wěn)定、免遭降解的目的。 但同時(shí)也給檢測(cè)技術(shù)帶來了難題， 即如何從沸石吸附的框架中有效的提取目標(biāo)維生素成為檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵。

唐登勇等（2010）發(fā)現(xiàn)，天然沸石對(duì)NH4+具有很好的選擇吸附性， 即使在有干擾陽(yáng)離子Ca2+、Mg2+存在時(shí)，仍顯示出良好的脫氨效果。 利用這一特性， 在優(yōu)化了維生素B1的液相色譜分離條件后，嘗試采用銨類化合物作為預(yù)混料的提取劑， 利用沸石對(duì)銨根離子優(yōu)先選擇吸附的性質(zhì)，達(dá)到置換硫胺根的目的。 本試驗(yàn)以沸石及其他多孔結(jié)構(gòu)的無機(jī)載體為基質(zhì)，添加一定量的維生素B1， 制備一定濃度的氯化銨溶液作為提取劑，提取基質(zhì)中的維生素B1。 通過建立氯化銨濃度與測(cè)定維生素B1回收率之間的關(guān)系， 證明氯化銨可用作解吸附劑釋放吸附在沸石結(jié)構(gòu)中的維生素B1，確定滿足解吸附效率時(shí)氯化銨的濃度以及用量，并通過對(duì)市場(chǎng)搜集樣品的測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)論。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Aglient 1100 高效液相色譜儀備二極管矩陣檢測(cè)器：美國(guó)安捷倫公司；電子分析天平（精度0.0001 g）：德國(guó)Sartorius 公司；帶溫控pH 計(jì)（精度0.01）：德國(guó)Lab 公司；超聲波提取器，美國(guó)Branson 公司；高速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速8000 r/min）：美國(guó)Sigma 公司；針頭過濾器0.45 μm（或0.2 μm）濾膜：美國(guó)安捷倫公司。

標(biāo)準(zhǔn)品維生素B1（硝酸硫胺素， 純度大于99%）：美國(guó)Sigma—Aldrich 公司；氯化銨（優(yōu)級(jí)純），庚烷磺酸鈉（PICB7，優(yōu)級(jí)純），冰乙酸（優(yōu)級(jí)純），三乙胺（色譜純），二水合乙二胺四乙酸二鈉（EDTA，優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；甲醇（色譜純）：美國(guó)Fisher 公司；水：Milli—Q Gradient 超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和提取溶液的配制 取硝酸硫胺素標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%），置于干燥器中干燥24 h。稱取0.01 g（精確至0.0001 g），溶解于酸性20%乙醇溶液中并定容至100 mL，該溶液含0.1 mg/mL維生素B1，可根據(jù)需要稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

提取液： 取107 g 氯化銨溶解于1000 mL 水中，用2 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH 為3 ～4；取900 mL氯化銨溶液與100 mL 甲醇混合。

1.3 樣品前處理 稱取試樣約3.0 g （精確到0.001 g），置于100 mL 棕色容量瓶中，加入提取液約70 mL， 邊加邊搖勻后置于超聲水浴中超聲提取30 min，冷卻，用提取液定容至刻度，搖勻。取少量溶液于離心機(jī)上8000 r/min 離心5 min，上清液過0.45 μm 微孔濾膜，上HPLC 測(cè)定。

1.4 色譜條件 日本島津ODS 3V C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量20 μL；流速為1 mL／min。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器或者二極管矩陣檢測(cè)器，波長(zhǎng)242 nm；流動(dòng)相為庚烷磺酸鈉溶液（0.005 mol/L，pH 3.7）-甲醇（80：20），V／V。1.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化 由于水溶性維生素是一大類有著相似結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的物質(zhì)， 從液相色譜分離角度， 無論測(cè)定哪一種維生素， 其他均為干擾項(xiàng)。因此，在色譜條件的考慮上首先需要將幾種水溶性維生素的分離度優(yōu)化至滿意， 才可以準(zhǔn)確測(cè)定某一種維生素。如果選擇等度淋洗，則需要利用添加了離子對(duì)的體系才可以滿足分離度要求。

在選擇離子對(duì)試劑時(shí)， 烷基鏈的長(zhǎng)度是必須考慮的因素， 因?yàn)樘兼湹拈L(zhǎng)度決定了對(duì)樣品的分離程度。碳鏈越長(zhǎng)，對(duì)離子的疏水性越強(qiáng)。 試驗(yàn)采用庚烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑， 通過添加冰乙酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 為3.7，使得6 種水溶性維生素的色譜得到較好的分離，并通過添加三乙胺，改善了堿性物質(zhì)的拖尾，使得色譜峰尖銳好看。6 種維生素的分離情況如圖1 所示。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化 對(duì)于復(fù)合預(yù)混合飼料，測(cè)定維生素B1長(zhǎng)期以來存在回收率不達(dá)標(biāo)的現(xiàn)象。 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14700-2002 “飼料中維生素B1的測(cè)定”中采用14%甲醇水（pH 3.2）作為流動(dòng)相，并用此流動(dòng)相進(jìn)行樣品提取。在選擇不同預(yù)混合飼料樣品（飼料樣品來自于企業(yè)的商品飼料）進(jìn)行試驗(yàn)與標(biāo)示值進(jìn)行對(duì)比計(jì)算回收率，發(fā)現(xiàn)大多未達(dá)到要求（表1）。

表1 14%甲醇水（pH 3.2）提取復(fù)合預(yù)混合飼料回收率結(jié)果

從對(duì)預(yù)混料的檢測(cè)結(jié)果看，回收率為50% ～122%，多數(shù)樣品的回收率未達(dá)到85%。在逐一排除造成回收率低下的原因，如微量元素、抗氧化劑、各類藥物、鹽類后，將試驗(yàn)重點(diǎn)落在載體的選擇上。 最終的結(jié)果顯示，在有沸石存在時(shí)，目標(biāo)化合物回收較低， 而且回收率隨沸石量增加而降低。

明確了由于沸石的吸附作用導(dǎo)致維生素B1提取出現(xiàn)困難這一問題后，解決吸附成為關(guān)鍵點(diǎn)。如何與硫胺素競(jìng)爭(zhēng)沸石的多孔結(jié)構(gòu)是解決問題的關(guān)鍵。 受沸石吸附氨氮機(jī)理的啟發(fā) （高俊敏，2001）， 天然沸石對(duì)NH4+具有很好的選擇性吸附作用（唐登勇，2010），常用于處理污水達(dá)到凈化目的（張英俊等，2008）。 試驗(yàn)遴選有機(jī)銨類化合物、無機(jī)銨類化合物，如氯化銨、磷酸二氫銨、四水合鉬酸銨、 草酸銨、N-N 二甲基甲酰銨作為進(jìn)取劑進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)， 使用相同用量時(shí)以氯化銨效果最佳。

為考察不同用量氯化銨對(duì)沸石解吸附的影響， 在不同重量的沸石中混入相同濃度的維生素B1， 后經(jīng)10%甲醇水提取15 min， 上液相色譜測(cè)定，從沸石中回收維生素B1的回收率（表2）。

表2 氯化銨用量對(duì)沸石解吸附的影響

結(jié)果表明，對(duì)于預(yù)混料而言，其中沸石含量越多，在料中占的比例越大，氯化銨解吸其中的維生素B1能力也會(huì)隨著下降。因此需要增加氯化銨使用量以滿足需要。 增加有機(jī)相對(duì)微量元素有某些抑制作用，而且會(huì)減少色譜分析中的溶劑效應(yīng)。選擇10%的甲醇與10%酸性氯化銨 （pH 約為4.0）溶液混合做為提取劑可以獲得比較滿意結(jié)果。 通過對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)定，當(dāng)預(yù)混料中維生素B1含量為50 ～1200 mg/kg 時(shí)，回收效果較好（表3）。

表3 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

2.3 方法線性方程和定量限 制備維生素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，精密移取一定量的維生素B1稀釋成一組標(biāo)準(zhǔn)系列， 使維生素B1含量為0.1 ～45.0 μg/mL，進(jìn)樣測(cè)試。 以濃度為X 軸，峰面積為Y 軸繪制曲線，建立相關(guān)線性方程。 如表4 所示。

表4 線性方程

選取空白基質(zhì)1%奶牛預(yù)混料進(jìn)行定量限以及2 倍定量限添加回收實(shí)驗(yàn)，按照噪音理論，定量限15 mg/kg， 該定量限以及2 倍定量限下的回收率大于95%。

結(jié)果表明，在優(yōu)化的色譜條件下，維生素B1濃度在0.1 ～45.0 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系， 定量限也滿足復(fù)合預(yù)混料添加量范圍內(nèi)的檢測(cè)需要。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn) 由于預(yù)混合飼料對(duì)于維生素B1很難找到空白料，因此實(shí)驗(yàn)選擇了豬預(yù)混料、雞預(yù)混料、鴨預(yù)混料為測(cè)試樣本，在原樣品基礎(chǔ)上進(jìn)行強(qiáng)化添加，回收率數(shù)據(jù)滿足要求。 結(jié)果見表5。

表5 強(qiáng)化添加回收率結(jié)果

3 討論

3.1 預(yù)混料中維生素B1穩(wěn)定性與沸石的吸附性能 沸石晶格內(nèi)部開放性很大，除了有（Al、Si、O）四面體從角頂相互連結(jié)，形成架狀硅鋁氧骨干外，還有很多大小均一的孔穴和通道， 孔穴通過開孔的通道彼此相通， 使得沸石具有巨大的比表面積（謝洪剛等，2006），因而具有強(qiáng)大的吸附性能。

沸石空間最基本的結(jié)構(gòu)單位是硅氧（Si04）四面體和鋁氧（AIO）四面體。 其中1 個(gè)氧原子的價(jià)電子沒有得到中和， 使得整個(gè)鋁氧四面體帶一個(gè)負(fù)電荷，為了保持中性，鋁氧四面體附近必須有一個(gè)帶正電荷的金屬陽(yáng)離子（M+）來抵消其所帶的負(fù)電荷（通常是堿金屬或堿土金屬離子）。 維生素B1活性成分硫胺素作為陽(yáng)離子基團(tuán)與氯離子或者硝酸根離子結(jié)合形成穩(wěn)定的鹽。 也就是通常所說的鹽酸硫胺素或者硝酸硫胺素。 沸石一個(gè)特點(diǎn)就是對(duì)于SO2和NH3的吸附選擇性，使得維生素B1易于結(jié)合在多孔框架中穩(wěn)定存在。

3.2 沸石所具有的離子交換性能與解吸附 沸石為一種無機(jī)離子交換樹脂， 具有交換陽(yáng)離子的能力（謝洪剛等，2006），可以通過分子氨的吸附和離子氨的交換除去水中的氨氮（李日強(qiáng)等，2008）。由于NH4+的離子半徑為2.86 A。， 較容易進(jìn)入4.00A。的沸石孔道。 高英俊等（2001）通過在溶液中引入NH4+離子而置換出被吸附的硫胺根離子成為可能。

本研究利用沸石對(duì)某些陽(yáng)離子吸附和交換的原理， 建立了復(fù)合預(yù)混合飼料中維生素B1測(cè)定前處理方法。通過使用10%氯化銨甲醇提取復(fù)合預(yù)混合飼料，使得提取效率較14%甲醇水作為提取劑提高20%。通過添加回收實(shí)驗(yàn)以及商品飼料的測(cè)定，證明了在有沸石做載體的預(yù)混合飼料測(cè)定其中的維生素B1時(shí)， 該方法測(cè)定的有效和準(zhǔn)確性。