吳棟 于騰輝 李享 崔萌 郝影賓 劉麗華 羅麗萍

摘 要 煙草（Nicotiana tabacum L.）是植物科學(xué)研究的模式植物和我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，水澇脅迫是影響煙草品質(zhì)和產(chǎn)量的重要脅迫因子之一。本研究采用中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜（ND-EESI-MS）技術(shù)，在無(wú)需復(fù)雜的預(yù)處理的條件下，利用煙草中常見(jiàn)的絲氨酸作為優(yōu)化離子，對(duì)萃取劑種類(lèi)及流速、電噴霧電壓、樣品端輔助氣壓、霧化氣壓和離子傳輸管溫度等儀器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在最優(yōu)的條件下，共檢出水澇脅迫下煙草中絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酰甘氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、組氨酸、兒茶酚、麥芽酚、肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、白藜蘆醇、山奈酚、槲皮素、綠原酸、煙堿、降煙堿、苯乙醛、檸檬醛、蘋(píng)果酸和β-大馬烯酮共22種代謝產(chǎn)物。在應(yīng)對(duì)水澇脅迫時(shí)，煙草中脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和組氨酸等初生代謝產(chǎn)物含量增加，綠原酸、阿魏酸、咖啡酸、兒茶酚、苯乙醛、煙堿和降煙堿等次生代謝產(chǎn)物含量也呈上升趨勢(shì)。本研究從代謝組學(xué)層面上揭示水澇脅迫下煙草代謝產(chǎn)物的變化，為進(jìn)一步了解煙草響應(yīng)水澇脅迫提供了理論基礎(chǔ)。ND-EESI-MS應(yīng)用于水澇脅迫下煙草中代謝物檢測(cè)，具有靈敏度高、檢測(cè)范圍廣、可實(shí)現(xiàn)高通量快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，單個(gè)樣品的測(cè)定時(shí)間不超過(guò)1 min， 為煙草響應(yīng)水澇脅迫的代謝機(jī)理研究提供了新的植物代謝組學(xué)技術(shù)。

關(guān)鍵詞 中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜; 煙草; 水澇脅迫; 代謝組學(xué)

1 引 言

煙草（Nicotiana tabacum L.）為茄科煙草屬植物，是研究植物光周期、植物營(yíng)養(yǎng)、有機(jī)物代謝、逆境脅迫和轉(zhuǎn)基因等許多開(kāi)拓性研究的常用材料[1～3]，也是重要的模式植物。煙草中煙堿含量較高，煙堿具有較高的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，對(duì)精神分裂癥[4]和帕金森綜合癥[5]等疾病具有一定的療效。煙草也是我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)作物之一，其中南方地區(qū)占94%[6]。煙草生長(zhǎng)季節(jié)時(shí)在南方降雨量較大，煙田地面的積水無(wú)法及時(shí)排除，導(dǎo)致煙草植株根部缺氧，抑制其生長(zhǎng)，多地?zé)熑~生產(chǎn)均受到不同程度水澇脅迫的影響。植物代謝組學(xué)不僅可了解植物代謝物的時(shí)空積累模式，還能夠研究其成分和含量在不同外界環(huán)境條件下的變化情況[7]，因此可為解析煙草應(yīng)對(duì)水澇脅迫的調(diào)控機(jī)理提供指引。

目前，常用于植物代謝組學(xué)分析的方法主要有核磁共振法[8]、色譜法[9]和質(zhì)譜法[10，11]等，關(guān)于煙草的代謝組學(xué)研究已有報(bào)道，如Zhao等[12]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatography-mass spectrometry， LC-MS）的多平臺(tái)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)打頂和非打頂烤煙葉中的初生、次生和脂類(lèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了綜合研究; Zhao等[13]基于GC-MS和毛細(xì)管電泳-飛行時(shí)間質(zhì)譜（Capillary electrophoresis-time-of-flight-mass spectrometry， CE-TOF-MS）考察了烤煙生長(zhǎng)狀況和環(huán)境因素間的關(guān)系; Fu等[14]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry， UPLC-MS）技術(shù)對(duì)煙草多酚的組成進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)海拔高度和緯度對(duì)煙草葉片中多酚物類(lèi)質(zhì)及其抗氧化活性具有一定的影響。

直接質(zhì)譜技術(shù)指無(wú)需進(jìn)行樣品復(fù)雜預(yù)處理，可直接對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行快速分析的質(zhì)譜技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析、生命科學(xué)、食品安全、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，在代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[15～18]。中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜（Neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry，ND-EESI-MS）是由ESI電離源加以改進(jìn)得到，適用范圍更加廣泛，可直接對(duì)樣品中的物質(zhì)進(jìn)行解吸化學(xué)電離和質(zhì)譜分析，具有快速、靈敏、實(shí)時(shí)在線、能夠承受復(fù)雜基體樣品等優(yōu)點(diǎn)[19， 20]。目前，采用ND-EESI-MS已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)健康和肺癌患者痰樣的快速有效區(qū)分[21]，也實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中化學(xué)污染物的快速、直接質(zhì)譜檢測(cè)[22]，但植物代謝組學(xué)的研究還比較缺乏，且極少有研究針對(duì)ND-EESI-MS技術(shù)各環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化。

本研究采用ND-EESI-MS技術(shù)對(duì)水澇脅迫下煙草代謝組學(xué)進(jìn)行研究，首先對(duì)萃取劑、萃取劑流速、電噴霧電壓、樣品端輔助氣壓、霧化氣壓和離子傳輸管溫度等儀器參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，對(duì)水澇脅迫下煙草中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行直接質(zhì)譜檢測(cè)，共檢測(cè)到氨基酸、多酚、生物堿等22種代謝產(chǎn)物。本研究建立了一種綠色、原位、快速分析煙草中代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法，為植物代謝組學(xué)研究提供了新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

中性解吸-電噴霧萃取電離源（ND-EESI，江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）[21，22]; LTQ-XL型線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司），配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng); Millipore超純水儀（美國(guó)Millipore公司）; 手握式單孔打孔機(jī)（上海市堅(jiān)明辦公用品有限公司）。甲醇（色譜純，美國(guó)Dikma公司）; 絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸、亮氨酸、組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）; 煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（百靈威科技有限公司）。

供試材料為K326煙草種子，為江西及全國(guó)廣泛種植烤煙品種，由江西省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站提供。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 煙草樣品的準(zhǔn)備 選取大小一致的飽滿(mǎn)煙草種子（200粒），4℃浸水處理3 d，將種子置于育苗盤(pán)培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)土/蛭石/珍珠巖=4∶2∶1，質(zhì)量比）中，在28℃培養(yǎng)室中避光處理，進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。煙草生長(zhǎng)至2葉期時(shí)移栽，將長(zhǎng)勢(shì)一致的煙草幼苗移栽至花盆（口徑100 mm，高90 mm），每盆1株。培養(yǎng)溫度為28℃，相對(duì)濕度為80%，光照條件為16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為120 μmol/（m2·s）， 培養(yǎng)4周后進(jìn)行水澇脅迫處理。

實(shí)驗(yàn)分為脅迫處理組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，脅迫處理組采用雙套盆法，即在盆外側(cè)套不透氣塑料袋后置于另一個(gè)盆內(nèi)，脅迫水位維持在高于土壤表面15 mm，分別脅迫1、3、5和7 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。煙草幼苗培養(yǎng)至6葉期，以幼苗自上而下第3或4片完全展開(kāi)葉為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)材料。為規(guī)范操作、均勻采樣且避免個(gè)體差異，用打孔器均勻地在煙草葉片上打孔取樣，置于2 mL離心管，每個(gè)離心管裝12片煙草圓片，置于冰盒中待測(cè)。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)條件 ND-EESI-MS實(shí)驗(yàn)裝置原理圖和實(shí)驗(yàn)參數(shù)如圖1所示，采用正離子模式檢測(cè)，樣品通道與萃取劑通道夾角α=60°，樣品通道口與質(zhì)譜口的垂直夾角β=150°， 毛細(xì)管尖端與質(zhì)譜口距離d=5.0 mm，鞘氣為N2（純度99.99%），質(zhì)譜掃描范圍為m/z 50～400。碰撞誘導(dǎo)解離（Collision induced dissociation， CID）實(shí)驗(yàn)時(shí)，母離子隔離寬度為1.2 Da， 碰撞能量為10%～30%，碰撞時(shí)間為30 ms。其它參數(shù)由LTQ-MS軟件系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化。利用N2將樣品在EESI環(huán)境中進(jìn)行離子化，通過(guò)電場(chǎng)和萃取劑的作用，樣品前端產(chǎn)生大量承載待測(cè)物的微小帶電液滴去溶劑化后得到氣態(tài)待測(cè)物離子，進(jìn)入到質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.3 代謝物的檢測(cè) 采用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)水澇脅迫下煙草葉中代謝產(chǎn)物進(jìn)行ND-EESI-MS檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的煙葉成分及質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜排除假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)可能的物質(zhì)進(jìn)行CID實(shí)驗(yàn)，獲得二級(jí)指紋圖譜信息。根據(jù)不同的二級(jí)碎片以及參考標(biāo)準(zhǔn)品和NIST、PubChem、MassBank質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析，確定煙草葉片中的代謝產(chǎn)物，以煙草中代謝物的指紋圖譜信號(hào)強(qiáng)度對(duì)代謝物含量進(jìn)行相對(duì)定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.1.1 萃取劑的優(yōu)化 分別采用不同萃取劑（水、乙醇、乙醇-水、甲醇、甲醇-水）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，其中甲醇-水和乙醇-水的體積比均為1∶1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，ND-EESI-MS特征碎片離子（m/z 88）的絕對(duì)信號(hào)強(qiáng)度在甲醇為萃取劑時(shí)最高，考慮到對(duì)樣品信息盡多地獲取，且有些氨基酸物質(zhì)難溶于有機(jī)溶劑，并綜合5種萃取劑的萃取效果，選擇甲醇-水（1∶1， V/V）進(jìn)行下一步參數(shù)優(yōu)化。

3.1.2 電噴霧電壓的優(yōu)化 采用甲醇-水（1∶1，? V/V）作為萃取劑，以絲氨酸的特征碎片離子m/z 88的絕對(duì)信號(hào)強(qiáng)度為指標(biāo)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化?？疾祀妵婌F電壓分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 kV的結(jié)果，如圖3A所示。隨著電噴霧電壓的增大，m/z 88的信號(hào)強(qiáng)度逐漸增大，在4.5 kV時(shí)達(dá)到最高。但由于質(zhì)譜儀的電噴霧電壓不能過(guò)高，未繼續(xù)增加電壓強(qiáng)度，因此本研究采用電噴霧電壓為4.5 kV。

3.1.3 萃取劑流速的優(yōu)化 分別考察萃取劑流速為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 μL/min的檢測(cè)性能，結(jié)果如圖3B所示。隨著萃取劑流速的增大，m/z 88的信號(hào)強(qiáng)度先增大后減小，在3.0 μL/min時(shí)達(dá)到最高，在此流速下質(zhì)譜信號(hào)最佳，故本研究采用萃取劑流速為3.0 μL/min。

3.1.4 樣品端輔助氣壓的優(yōu)化 樣品端輔助氣壓分別采用0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 MPa，優(yōu)化結(jié)果如圖3C所示。隨著氣壓增大，m/z 88的信號(hào)強(qiáng)度呈緩慢上升趨勢(shì)，變化不明顯，其中，在氣壓為1.0和1.2 MPa時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度相同，1.4 MPa時(shí)達(dá)到最高。進(jìn)行多組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氣壓為1.2和1.4 MPa時(shí)，后期進(jìn)樣的m/z 88的信號(hào)不穩(wěn)定，信號(hào)會(huì)逐漸變?nèi)酢６覙悠范溯o助氣壓變化對(duì)m/z 88的信號(hào)強(qiáng)度影響不明顯，因此本研究中樣品端輔助氣壓采用1.0 MPa。

3.1.5 霧化氣壓的優(yōu)化 考察霧化氣壓分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 MPa時(shí)對(duì)檢測(cè)的影響，結(jié)果如圖3D所示。隨著氣壓增大，m/z 88的信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在1.4 MPa時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)質(zhì)譜效果最佳。因此本實(shí)驗(yàn)中霧化氣壓采用1.4 MPa。

3.1.6 離子傳輸管溫度的優(yōu)化 離子傳輸管溫度分別采用100、150、200、250、300和350℃，優(yōu)化結(jié)果如圖3E所示，隨著離子傳輸管溫度的增大，m/z 88的信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，離子傳輸管溫度在300℃時(shí)達(dá)到最大。本研究中離子傳輸管溫度采用300℃。

3.2 煙草葉片的ND-EESI-MS指紋圖譜分析

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，采用ND-EESI-MS直接檢測(cè)煙草葉片樣品，獲取了實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和水澇脅迫1、3、5和7 d下煙草樣品的指紋圖譜信息。每個(gè)樣品僅用1 min即可獲得如圖4所示的一級(jí)指紋圖譜，可以實(shí)現(xiàn)高通量快速檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和水澇脅迫組5組煙草樣品的一級(jí)指紋圖譜上基本是以m/z 163作為基峰，且都有明顯的m/z 106、132和163等離子峰，但在不同處理下的一級(jí)質(zhì)譜圖中各質(zhì)荷比的豐度存在差異，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中m/z 200～400離子峰數(shù)目明顯比脅迫處理組多，m/z 132隨著脅迫時(shí)間增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，m/z 180和211在脅迫后期才出現(xiàn)。

選擇m/z 106為母離子進(jìn)行二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析，如圖5A所示。母離子m/z 106（C3H7NO3）失去質(zhì)量數(shù)為18（H2O）的碎片，產(chǎn)生m/z 88的主要碎片離子，并且這也與絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)碎片行為一致，因此最終將m/z 106歸屬為絲氨酸。選擇一級(jí)指紋圖譜中豐度高的m/z 163（C10H14N2）進(jìn)行二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析，如圖5B所示。母離子m/z 136失去質(zhì)量數(shù)為31（CH5N）的碎片產(chǎn)生特征碎片離子m/z 132，以及丟失C3H7N得到特征碎片離子m/z 106，這與煙堿標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)碎片行為一致，因此最終確定m/z 163為煙堿。

3.3 ND-EESI-MS鑒定煙草中的代謝產(chǎn)物

采用ND-EESI-MSn方法，共鑒定出水澇脅迫下煙草中22種代謝產(chǎn)物，其中包含絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酰甘氨酸、亮氨酸、天冬酰胺和組氨酸7種氨基酸，兒茶酚、麥芽酚、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸、白藜蘆醇、山柰酚、槲皮素和綠原酸9種酚類(lèi)物質(zhì)，煙堿和降煙堿2種生物堿，苯乙醛和檸檬醛2種醛類(lèi)物質(zhì)，以及蘋(píng)果酸和β-大馬烯酮。表1中列舉了各化合物名稱(chēng)、分子式、母離子（[M+H＼]+）以及二級(jí)碎片離子（m/z）。

3.4 水澇脅迫下煙草中代謝產(chǎn)物相對(duì)含量的熱圖分析

以煙草中代謝物的指紋圖譜信號(hào)強(qiáng)度對(duì)代謝物含量進(jìn)行相對(duì)定量，圖6為利用ND-EESI-MS技術(shù)檢測(cè)得到的化合物相對(duì)含量變化熱圖，從圖6中可直觀看出不同水澇時(shí)間脅迫下煙草代謝物相對(duì)含量變化情況。煙草在應(yīng)對(duì)水澇脅迫時(shí)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，煙草中兒茶酚、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、麥芽酚、谷氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酰甘氨酸、苯乙醛、煙堿、降煙堿等物質(zhì)相對(duì)含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，肉桂酸和亮氨酸含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，山奈酚、白藜蘆醇、槲皮素、絲氨酸、蘋(píng)果酸、檸檬醛、β-大馬烯酮等物質(zhì)含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。

氨基酸作為植物體中重要的氮代謝物，對(duì)植株的氮代謝及壓力脅迫下植株的抗性都具有重要的作用[23]。脯氨酸在許多植物中是一種優(yōu)質(zhì)的滲透壓調(diào)節(jié)劑，煙草在應(yīng)對(duì)水澇脅迫時(shí)，隨著水澇脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，脯氨酸含量上升。谷氨酸、絲氨酸、組氨酸等氨基酸參與了植物體內(nèi)γ-氨基丁酸（GABA）的合成[24]，其含量也都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。莽草酸-苯丙素途徑與植物逆境脅迫密切相關(guān)[25]，參與其途徑的綠原酸含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其下游的阿魏酸和咖啡酸含量整體也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)以響應(yīng)水澇脅迫，而兒茶酚、槲皮素、白藜蘆醇、山奈酚、蘋(píng)果酸等多酚類(lèi)化合物含量都有所增加，煙草中重要的煙堿、降煙堿等物質(zhì)也都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在應(yīng)對(duì)水澇脅迫過(guò)程中，煙草產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，其代謝物含量也會(huì)相應(yīng)地升高或降低，激發(fā)一系列代謝物合成，以幫助煙草修復(fù)損傷或達(dá)到新的代謝平衡。

4 結(jié) 論

采用ND-EESI-MS技術(shù)，選用煙草中常見(jiàn)的絲氨酸作為優(yōu)化離子，對(duì)萃取劑種類(lèi)、萃取劑流速、電噴霧電壓、樣品端輔助氣壓、霧化氣壓和離子傳輸管溫度等實(shí)驗(yàn)儀器參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。 在優(yōu)化條件下，無(wú)需樣品復(fù)雜預(yù)處理， 直接檢測(cè)到水澇脅迫下煙草中22種代謝產(chǎn)物，單個(gè)樣品的測(cè)定時(shí)間不超過(guò)1 min。在應(yīng)對(duì)水澇脅迫時(shí)，煙草中脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸等初生代謝產(chǎn)物與滲透調(diào)節(jié)和GABA合成相關(guān)，其含量都有所增加，綠原酸、阿魏酸和咖啡酸等參與植物體內(nèi)莽草酸-苯丙素途徑，其含量也都有所增加，兒茶酚、苯乙醛、煙堿和降煙堿等次生代謝產(chǎn)物含量也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)以響應(yīng)水澇脅迫。本研究結(jié)果從代謝組學(xué)層面上揭示了水澇脅迫下煙草代謝產(chǎn)物的變化，為進(jìn)一步了解煙草響應(yīng)水澇脅迫提供了理論基礎(chǔ)。本研究建立了一種綠色、原位、快速分析煙草中代謝產(chǎn)物的技術(shù)，為研究植物代謝組學(xué)提供了參考。

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Abstract Tobacco （Nicotiana tabacum L.） is a model plant for plant science research and one of the important economic crops， and waterlogging stress is one of the most important factors affecting the quality and yield of Nicotiana tabacum. In this study， the instrument parameters such as the type of extractant， the flow rate of extractant reagent， the electrospray voltage， the pressure of sample auxiliary， the pressure of extractant reagent and the temperature of ion transfer tube were optimized by serine， which was common in Nicotiana tabacum as an optimized ion. A total of 22 metabolites of Nicotiana tabacum were obtained under waterlogging stress by neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry （ND-EESI-MS） without any sample pretreatment， including serine， proline， glutamic， D，L-alanyl-glycine， leucine， asparagine， histidine， catechol， maltol， cinnamic acid， caffeic acid， ferulic acid， resveratrol， kaempferol， quercetin chlorogenic acid， nicotine， nornicotine， phenylacetaldehyde， citral， malic acid adn β-damascenone. In response to waterlogged stress， the contents of proline， glutamic acid， serine， histidine about primary metabolites in Nicotiana tabacum were increased， and the contents of secondary metabolites such as chlorogenic acid， ferulic acid， caffeic acid， catechol， phenylacetaldehyde， nicotine and nornicotine were also increased. The results exhibited the metabolites changes of Nicotiana tabacum under waterlogging stress， and thus provided a theoretical basis for further understanding the response to waterlogging stress in Nicotiana tabacum. Accordingly， the application of ND-EESI-MS in plant in-situ detection had many advantages such as high sensitivity， wide detection range， high throughput and rapid detection （less than 1 minute for detection of a single sample）. Also it provided a new plant metabolomics technique for enriching the metabolic mechanism of Nicotiana tabacum in response to waterlogging stress.

Keywords Neutral desorption-extractive electrospray ionization mass spectrometry; Nicotiana tabacum L; Waterlogging stress; Metabolomics