王雨濃 李 賢 吳樂樂 周 莉馬曉娜 李 軍

(1.中國科學院海洋研究所 中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室 青島 266071；2.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室 青島 266071；3.中國科學院海洋大科學研究中心 青島 266071；4.中國科學院大學 北京 100049)

動物的視覺功能與其交配、覓食和躲避天敵等行為密切相關。視色素介導視覺形成的第一步是由G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)視蛋 白(opsin)和發(fā)色團(chromophore)共價結(jié)合形成。當光子被吸收后,發(fā)色團由11-順式異構(gòu)化為全反式,從而引起視蛋白構(gòu)象的改變,進而激活光感受器的下游轉(zhuǎn)導通路,并最終傳遞光信號(Nathans,1987)。魚類的視覺系統(tǒng)同大部分脊椎動物一樣,基因組中都有五個視蛋白基因亞家族：視桿細胞中表達的視紫紅質(zhì)(RH1,Rhodopsin),以及視錐細胞中表達的四種：紅視蛋白(M/LWS,red-sensitive)、紫外視蛋白(SWS1,ultraviolet-sensitive)、藍視蛋白(SWS2,blue-sensitive)和綠視蛋白(RH2,green-sensitive)(李志強等,2009；劉楚吾等,2015)。

魚類通過基因復制形成了多樣的視蛋白庫,以此來適應水體光環(huán)境變化的需要(Chinenet al,2003；Matsumotoet al,2006；Wardet al,2008；Rennisonet al,2012；Nakamuraet al,2013)。其在不同發(fā)育時期視蛋白表達種類與組成的變化,被認為與光譜環(huán)境的識別與適應相關,如鮭科魚類(salmonid)視網(wǎng)膜中紫外敏感的視錐細胞在變態(tài)過程中消失,為進入更深的水域做準備,在其性成熟并返回淺水層后重新出現(xiàn)(Bowmakeret al,1987；Kunzet al,1994；Flamarique,2000；Allisonet al,2006)。虹鱒(Oncorhynchus mykiss)單錐細胞表達的視蛋白,隨著發(fā)育由SWS1轉(zhuǎn)變?yōu)镾WS2(Chengetal,2007)。此外,斑馬魚(Daniorerio)、慈鯛(Cichlids)、孔雀魚(Poeciliareticulata)等物種中也表現(xiàn)出視蛋白表達隨發(fā)育呈動態(tài)變化的特征(Takechiet al,2005；Carletonetal,2008；Laveretal,2011；H?reretal,2017)。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、鲆科(Bothidae)、菱鲆屬(Scophthalmus),生長快、耐低溫,是我國重要的海水養(yǎng)殖品種之一。大菱鲆早期發(fā)育過程中,經(jīng)歷重要的變態(tài)過程,由浮游生活轉(zhuǎn)變?yōu)榈讞?生存環(huán)境尤其光照環(huán)境變化巨大。然而其視蛋白種類及表達模式的研究卻未見報道。本研究以大菱鲆為對象,研究不同發(fā)育階段大菱鲆視蛋白組成、基因表達特征、光譜敏感性變化及其對光譜環(huán)境變化的響應,以期在理論上深入理解魚類視覺發(fā)育規(guī)律、可塑性及對環(huán)境的適應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗用大菱鲆取自威海圣航水產(chǎn)科技有限公司,分別為1月齡(0.15±0.09g)、4月齡(7.24±0.18g)和9月齡(40.68±0.97g)人工繁育的健康稚、幼魚。樣本采集前用300mg/LMS-222麻醉,隨后立即摘除眼睛并置于液氮中保存,用于視蛋白qPCR分析。

1.2 數(shù)據(jù)庫搜索與引物設計

大菱鲆視蛋白序列通過BLASTn和BLASTp以默認參數(shù)搜索NCBI和Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得(Altschulet al,1990),斑馬魚和牙鲆視蛋白序列用作檢索參照(Chinenet al,2003；Kasagiet al,2018)。序列相似性由ClustalW2網(wǎng)站獲得,并利用MEGA7.0中鄰接法(Neigh-borJoining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。qPCR引物使用PrimerPre mier 5.0設計,具體見表1。內(nèi)參基因β-actin使用引物見文獻(Danget al,2011)。

表1 qRT-PCR所用引物及相應退火溫度和擴增效率Tab.1 Nucleotide sequences of oligonucleotide primers

1.3 總RNA提取與cDNA第一鏈合成

實驗用RNA提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司,用Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度及純度,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶完整性。隨后,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)合成大菱鲆cDNA第一鏈,-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時熒光定量PCR

以β-actin為內(nèi)參基因,每個樣品設置三個復孔。總反應體系為20μL：cDNA 1.6μL,上下游引物各0.4μL,TB Green Premix Ex Taq 10μL(TaKaRa),RNase free H2O 7.6μL。熒光定量反應條件如下：95°C 3min；95°C 10s；57/58°C 30s；72°C 30s；40個循環(huán)。引物特異性采用CFX-96軟件(Bio-Rad公司)進行高溫熔解曲線分析和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并以5倍梯度稀釋模板獲得引物擴增效率。相對表達量計算采用2-ΔΔCt法,統(tǒng)計分析使用SPSS19.0軟件,以“LSD”單因素方差分析法對不同發(fā)育階段大菱鲆視蛋白表達量進行比較。當P＜0.05時,即為差異顯著。

1.5 視蛋白表達相對比例的計算

參照相關文獻方法(Fulleret al,2004；H?reret al,2017),對大菱鲆不同階段,視錐細胞中各視蛋白表達比例的計算采用如下公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 大菱鲆視蛋白基因類別

大菱鲆擁有5類視蛋白基因,分別為視桿細胞中的視紫紅質(zhì)(RH1),視錐細胞中的紫外視蛋白(SWS1,AWO98359)、紅視蛋白(LWS,AF385826)、藍視蛋白(SWS2,AWP03347)以及綠視蛋白(RH2),其中綠視蛋白基因有五個亞型。序列相似性分析(表2)表明RH2a1和RH2a2及RH2b1和RH2b2之間的序列相似性更高。系統(tǒng)發(fā)生樹分析(圖1)表明RH2a1和RH2a2及RH2b1和RH2b2分別聚為一支,故綠視蛋白基因五個亞型暫命名為RH2a1、RH2a2、RH2b1、RH2b2和RH2c。視紫紅質(zhì)和綠視蛋白相關序列已提交到NCBI,視紫紅質(zhì)序列號為MN073188,綠視蛋白五個基因分別為MN073190-MN073194。

表2 大菱鲆視蛋白基因序列相似性分析Tab.2 Sequence similarity among S.maximus opsins

圖1 大菱鲆視蛋白核酸序列鄰接法建樹Fig.1 A phylogenetic tree constructed by the Neighbor-Joining method for nucleotide sequences of S.maximus opsins

2.2 不同發(fā)育階段大菱鲆視紫紅質(zhì)基因表達量的變化

1月齡大菱鲆視紫紅質(zhì)基因RH1表達量較低,其后表達量逐漸增加,但4月齡和9月齡大菱鲆桿視蛋白表達量無顯著差異(圖2)。

圖2 大菱鲆稚、幼魚視紫紅質(zhì)基因(RH1)相對表達量隨生長發(fā)育的變化Fig.2 Relative expression of RH1 during the development of juvenile S.maximus

2.3 不同發(fā)育階段大菱鲆錐視蛋白基因表達量的變化

大菱鲆錐視蛋白基因相對表達量隨發(fā)育的變化見圖3。其中,LWS相對表達量在1月齡最高,其后逐漸降低；SWS1和SWS2在9月齡的相對表達量均顯著高于1、4月齡,且1、4月齡之間無顯著差異；綠視蛋白中RH2a1和RH2b2在4、9月齡相對表達量顯著低于1月齡；RH2a2和RH2b1在三個時期表達量均無顯著變化；RH2c在1、4月齡相對表達量無明顯變化,而9月齡時顯著降低。

圖3 大菱鲆稚、幼魚錐視蛋白基因相對表達量隨生長發(fā)育的變化Fig.3 Relative expression of cone opsin genes during the development of juvenile S.maximus

2.4 大菱鲆個體發(fā)育中視蛋白表達比例的變化

大菱鲆錐視蛋白中,LWS、RH2b1和RH2c為表達比例最高的三個錐視蛋白基因,三者表達比例之和在三個階段均超過95%(圖4)。1月齡時,LWS為表達比例最高的錐視蛋白,超過總量的50%。隨著大菱鲆的生長發(fā)育,LWS表達比例逐漸降低,到9月齡時減少至約6%。RH2b1則剛好相反,1月齡時表達量約占29.9%,9月齡時升高至75.1%,成為表達量最高的錐視蛋白。RH2c的表達比例從1月齡至9月齡略微增加,由9.2%升高至14.8%。

在其他未占優(yōu)勢錐視蛋白基因中,SWS1和SWS2表達比例均在9月齡時顯著增加。綠視蛋白中RH2a1表達比例隨著發(fā)育逐漸降低,至9月齡時所占比例幾乎為零；RH2a2在三個時期表達比例無顯著變化,且均不超過0.2%；RH2b2在4月齡的表達比例不足0.2%,顯著低于1、9月齡(表3)。

圖4 大菱鲆三種主要視蛋白表達比例隨生長發(fā)育的變化Fig.4 Proportional expression of three main opsin during the development of juvenile S.maximus

3 討論

3.1 大菱鲆綠視蛋白基因的多拷貝性

魚類視蛋白基因的多拷貝事件報道較多,其中以綠視蛋白基因RH2最為常見(劉楚吾等,2015)。如斑馬魚(Danio rerio)的RH2基因通過復制形成了光譜敏感峰值(λmax)各不相同的四個基因,串聯(lián)排列在基因組上(Chinenet al,2003)。而紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)和黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)的RH2也發(fā)生了加倍,但它們的RH2-2趨同退化為假基因(Neafseyet al,2005)。在已有報道中,太平洋藍鰭金槍魚(Thunnus orientalis)RH2基因最多,其至少有5個旁系同源基因。相關氨基酸位點替換導致光譜敏感藍移,形成不同λmax的綠視蛋白亞型,進而增強了太平洋藍鰭金槍魚對藍光的識別能力(Nakamuraet al,2013)。在大菱鲆視蛋白基因中,我們發(fā)現(xiàn)其有五個RH2基因,推測RH2基因的堿基替換引起λmax的改變,可能是變態(tài)后大菱鲆對深海短光譜為主的光照環(huán)境的一種適應表現(xiàn)。

表3 大菱鲆錐視蛋白各基因表達比例(%)Tab.3 Proportional expression of different cone opsin during the development of juvenile S.maximus

3.2 大菱鲆發(fā)育過程中視蛋白基因表達特征變化

視蛋白基因在魚體發(fā)育不同階段表達的不一致性,是其適應不同發(fā)育階段下各異光譜環(huán)境的強大機制之一(Chenget al,2004；Carletonet al,2008)。大菱鲆在仔稚魚期營浮游生活,變態(tài)后則轉(zhuǎn)營底棲生活。本實驗結(jié)果表明,大菱鲆雖然經(jīng)歷長時間的養(yǎng)殖馴化,但其可能仍保留了野生狀態(tài)的視蛋白表達模式：從1月齡至9月齡,大菱鲆桿視蛋白基因表達量增加；大菱鲆在進入更深的水層后,棲息環(huán)境光線逐漸變暗,需要更多的視紫紅質(zhì)。

在錐視蛋白中,LWS表達量逐漸降低,SWS1和SWS2表達量逐漸升高,綠視蛋白中占主導的RH2b1表達量無顯著變化。大菱鲆變態(tài)前生存在表層水域,光線以長波長為主,變態(tài)后向更深的水層移動,光譜以中短波長為主。我們的結(jié)果表明大菱鲆變態(tài)前后顏色識別能力的轉(zhuǎn)變,正好與大菱鲆生活史(從浮游向底棲生活轉(zhuǎn)變)的視覺需求相吻合。條斑星鰈(Verasper moseri)有著與大菱鲆類似的生活史和光譜環(huán)境轉(zhuǎn)變,其在3—27月齡的發(fā)育過程中LWS表達逐漸降低,RH1表達升高,但SWS1和SWS2b表達量下降(Kasagiet al,2015)。南地刺鯛(Acanthopagrus butcheri)在仔魚期視蛋白表達以SWS1、SWS2b和RH2aα為主,而SWS2a、RH2aβ和LWS表達水平很低；然而在成魚中,視蛋白表達情況剛好相反,并且從仔魚到成蟲,RH1的相對表達水平上升了25倍(Shandet al,2008),這種變化可能與其稚魚期到以長波長為主的單寧酸污染河口水域生活有關(Shandet al,2002)。可見,魚類視蛋白表達的階段特征與發(fā)育中環(huán)境光譜變化密切相關。

3.3 大菱鲆發(fā)育過程中的光譜敏感性變化

發(fā)育過程中視蛋白基因表達比例的變化,可以在一定程度上推測魚類在不同發(fā)育階段的光譜敏感性。各錐視蛋白表達比例的計算結(jié)果表明,大菱鲆錐視蛋白在1月齡時LWS占主導,隨著發(fā)育,RH2b1逐漸取代了LWS高表達的地位。據(jù)此可推測：大菱鲆在變態(tài)前的1月齡可能對長波長的紅光更為敏感,而變態(tài)后可能對中短波長的綠光更敏感,與其生活史中光譜環(huán)境變化吻合。美洲擬鰈(Pleuronectes Americanus)擁有與大菱鲆類似的生活史,但其變態(tài)前只有RH2表達,意味著仔魚期的綠光高敏感性；變態(tài)后SWS2和LWS兩類錐視蛋白基因亦有表達,其光譜敏感性可能有所轉(zhuǎn)變(Maderet al,2004)。

本實驗中,9月齡大菱鲆SWS1表達比例顯著高于1、4月齡。然而大部分研究表明紫外敏感性的增強可能是不利的(Loseyet al,1999)。如羅非魚(Oreochromis niloticus)的紫外敏感性隨著發(fā)育逐漸降低,其仔魚期對紫外的高敏感性與攝食習性有關。浮游動物會吸收紫外線,仔魚的紫外視覺能夠增強浮游動物與海水背景顏色的對比,從而有助于其對浮游生物的捕捉(Sabbahet al,2012)；羅非魚成魚為雜食性,由于紫外線在水中的強烈散射造成視網(wǎng)膜圖像形成的模糊化,不利于其對大型水生植物及無脊椎動物的捕食。但大菱鲆9月齡SWS1所占比例依然很低,可能對光譜敏感性影響微乎其微。SWS2的表達比例變化亦不大,表明大菱鲆對藍光敏感程度可能亦無顯著變化。

4 結(jié)論

大菱鲆視蛋白基因在不同發(fā)育階段表達特征不同。1月齡LWS表達比例為57.2%,9月齡時降至11.4%；綠視蛋白從 1月齡 29.9%升高至 9月齡73.3%。表達占據(jù)主導地位的LWS逐漸被RH2b1取代,進而可能引起視覺敏感性由長波長轉(zhuǎn)變?yōu)橹卸滩ㄩL敏感。不同階段視蛋白表達特征變化引發(fā)的光譜敏感性轉(zhuǎn)變,可能是大菱鲆應對底棲光環(huán)境變化的一種適應策略。