段 斌，符 浩，王昕禧

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院泌尿外科， 湖南 衡陽 421002)

膀胱癌是常見實(shí)體惡性腫瘤，其早期的發(fā)病較為隱匿，且常常以隱匿性轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)，因此研究膀胱癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制對(duì)于膀胱癌的治療具有重要意義[1-3]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是一種近年來發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)，其在結(jié)直腸癌和肺癌等腫瘤中高表達(dá)，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)、侵襲和遷移等作用[4-5]。目前在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)MALAT1高表達(dá)與膀胱癌患者淋巴轉(zhuǎn)移等有關(guān)[6]，但對(duì)于MALAT1影響膀胱癌細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制尚不明確。有研究表明，MALAT1可以下調(diào)肝細(xì)胞癌細(xì)胞中微小RNA(microRNA, miR)-146b-5p的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[7]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以膀胱癌BIU-87細(xì)胞作為體外研究對(duì)象，探討MALAT1和miR-146b-5p對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響和機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

膀胱癌BIU-87細(xì)胞購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心腫瘤細(xì)胞庫。MALAT1 siRNA、siRNA control、miR-146b-5p mimics、mimics control、miR-146b-5p inhibitor和inhibitor control由上海吉瑪生物制藥有限公司構(gòu)建合成；cDNA合成試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；定量PCR試劑購自TaKaRa；抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase，MMP-2)抗體購自Cell Signaling Technology；抗波形蛋白(vimentin)抗體和抗上皮型鈣黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadhe-rin)抗體購自Abcam；突變型和野生型螢光素酶報(bào)告載體由廣州輝駿生物科技有限公司構(gòu)建；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol試劑購自Invitrogen；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成， MALAT1的上游引物序列為5’-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3’， 下游引物序列為5’-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGC-3’； miR-146b-5p的上游引物序列為5’-CCTGGCACTGAGAACTGAAT-3’， 下游引物序列為5’-GCACCAGAACTGAGTCCACA-3’； GAPDH的上游引物序列為5’-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游引物序列為5’-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’； U6的上游引物序列為5’-AGAGAGATTACATGGCCCCT-3’，下游引物序列為5’-CTAATGTCACGCACGATTCT-3’。

2 方法

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染和敲減效果檢測 用Lipofectamine 2000將MALAT1 siRNA和siRNA control轉(zhuǎn)染至BIU-87細(xì)胞中，步驟同轉(zhuǎn)染試劑說明書。把轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA和siRNA control后的細(xì)胞設(shè)置為si-MALAT1組和si-con組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞記為對(duì)照(control)組。Control、si-con和si-MALAT1組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后，以real-time PCR檢測敲減效果。

用TRIzol方法提取細(xì)胞總RNA，RNA保存在-80 ℃。取2 μg的RNA，用Oligo dT反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，步驟同cDNA合成試劑盒。合成cDNA保存在-20 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。熒光定量PCR體系為0.4 μL的SYBR Green qPCR Super Mix-UDG、1 μL的cDNA、8.4 μL的DEPC水和0.4 μL的引物。PCR程序?yàn)?95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)反應(yīng)的Ct值計(jì)算MALAT1的表達(dá)水平，方法為常規(guī)2-ΔΔCt法，內(nèi)參照設(shè)置為GAPDH。

2.2Transwell法檢測下調(diào)MALAT1后膀胱癌BIU-87細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化 用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將control、si-con和si-MALAT1組細(xì)胞配制成濃度為1×109/L的單細(xì)胞懸浮液，將100 μL的細(xì)胞懸浮液添加到Transwell小室的上室中，在下室中添加含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，放在37 ℃孵育48 h以后，用棉簽將沒有穿膜的細(xì)胞擦掉，用結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野分析細(xì)胞遷移數(shù)目。侵襲實(shí)驗(yàn)步驟同上，在侵襲實(shí)驗(yàn)前用基質(zhì)膠將小室濕化。

2.3Western blot檢測下調(diào)MALAT1后膀胱癌BIU-87細(xì)胞中MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平 在轉(zhuǎn)染48 h后的control、si-con和si-MALAT1組細(xì)胞中添加蛋白裂解液，放在冰上充分裂解提取細(xì)胞中的總蛋白。制備SDS-PAGE蛋白凝膠，本次實(shí)驗(yàn)以10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳。在蛋白樣品中添加5×上樣緩沖液，放在100 ℃孵育5 min。每個(gè)孔中添加30 μg的蛋白樣品，marker上樣量為5 μL。濃縮膠中電泳電壓為80 V，分離膠中電泳電壓為120 V，觀察染料進(jìn)入到膠板的底部以后，關(guān)閉電源，將凝膠取出。把裁剪好的NC膜放在甲醇中浸泡5 min，以100 V電壓在冰水混合物上轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為80 min。把NC膜放在封閉液(含有5%脫脂奶粉的TBST)中，在室溫條件下孵育1 h。用封閉液配制 I 抗反應(yīng)液(抗vimentin、E-cadherin抗體以1∶600稀釋，抗MMP-2抗體以1∶400稀釋)，把NC膜置于其中，在4 ℃孵育過夜。用封閉液配制1∶4 000稀釋的 II 抗反應(yīng)液，NC膜置于其中在室溫條件下結(jié)合1 h。用ECL法化學(xué)發(fā)光，用Quantity One分析掃描灰度值，GAPDH設(shè)置為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

2.4靶向預(yù)測和雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)的鑒定 利用生物信息學(xué)軟件Starbase 2.0分析得知MALAT1和miR-146b-5p有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。將MALAT1結(jié)合序列突變，構(gòu)建突變型螢光素酶報(bào)告載體(pmiRGLO-MALAT1-MUT)，同時(shí)構(gòu)建沒有突變的螢光素酶報(bào)告載體(pmiRGLO-MALAT1-WT)。將MALAT1-MUT和MALAT1-WT與miR-146b-5p mimics和mimics control共轉(zhuǎn)染至BIU-87細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，用螢光素酶活性檢測試劑盒檢測螢光素酶活性。設(shè)置轉(zhuǎn)染miR-146b-5p mimics和mimics control后的BIU-87細(xì)胞為miR-146b-5p組和miR-NC組。參照上述real-time PCR方法測定miR-146b-5p組和miR-NC組細(xì)胞miR-146b-5p的表達(dá)變化(內(nèi)參照為U6)。同時(shí)用real-time PCR檢測control、si-con、si-MALAT1、vector(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照載體pcDNA3.1)和MALAT1(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MALAT1)細(xì)胞中miR-146b-5p表達(dá)的變化(內(nèi)參照為U6)。

2.5miR-146b-5p inhibitor和MALAT1 siRNA共轉(zhuǎn)染對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞侵襲、遷移能力和MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響 在BIU-87細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-146b-5p inhibitor和MALAT1 siRNA及inhibitor control和MALAT1 siRNA，分別命名為Si-MALAT1+anti-miR-146b-5p組和si-MALAT1+anti-NC組，用real-time PCR、Transwell法和Western blot分別測定細(xì)胞中miR-146b-5p水平、侵襲及遷移數(shù)目和MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)變化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗(yàn)，多組差異比較用單因素方差，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MALAT1 siRNA下調(diào)膀胱癌BIU-87細(xì)胞中MALAT1表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果顯示，si-MALAT1組膀胱癌BIU-87細(xì)胞中MALAT1表達(dá)水平明顯低于si-con組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The changes of MALAT1 expression in bladder cancer BIU-87 cells transfected with MALAT1 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-con group.
圖1 MALAT1 siRNA轉(zhuǎn)染后膀胱癌BIU-87細(xì)胞中MALAT1表達(dá)的變化

2 下調(diào)MALAT1抑制膀胱癌BIU-87細(xì)胞侵襲、遷移和EMT

與si-con組比較，si-MALAT1組膀胱癌BIU-87細(xì)胞的侵襲和遷移數(shù)目明顯降低，同時(shí)細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)水平下降，間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志物vimentin蛋白水平降低，上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，見圖2。下調(diào)MALAT1具有抑制膀胱癌BIU-87細(xì)胞的侵襲、遷移能力和EMT的作用。

Figure 2. The effect of down-regulation of MALAT1 on the number of invasion (A) and migration (B) of bladder cancer BIU-87 cells and the changes of MMP-2, vimentin and E-cadherin protein levels (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-con group.
圖2 下調(diào)MALAT1后膀胱癌BIU-87細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)目及MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白水平的變化

3 MALAT1靶向調(diào)控miR-146b-5p

生物信息學(xué)軟件預(yù)測MALAT1和miR-146b-5p有靶向結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-146b-5p mimics后，細(xì)胞中的miR-146b-5p表達(dá)水平升高。MALAT1-WT和miR-146b-5p mimics共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞螢光素酶活性降低。MALAT1可靶向調(diào)控miR-146b-5p表達(dá)，見圖3。

Figure 3. MALAT1 targeted regulation of miR-146b-5p expression. A: bioinformatics software predicted the targeting binding sites of MALAT1 and miR-146b-5p; B: expression of miR-146b-5p after transfection; C: luciferase activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.
圖3 MALAT1靶向調(diào)控miR-146b-5p

4 MALAT1負(fù)調(diào)控miR-146b-5p表達(dá)

si-MALAT1組BIU-87細(xì)胞中miR-146b-5p的表達(dá)水平明顯高于si-con組(P<0.05)。MALAT1組BIU-87細(xì)胞中miR-146b-5p的表達(dá)水平明顯低于vector組(P<0.05)，見圖4。MALAT1可以負(fù)向調(diào)控膀胱癌BIU-87細(xì)胞中miR-146b-5p的表達(dá)水平。

Figure 4. The effects of MALAT1 on miR-146b-5p expression in the bladder cancer BIU-87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-con group;&P<0.05vsvector group.
圖4 敲減或上調(diào)MALAT1的表達(dá)對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞中miR-146b-5p表達(dá)水平的影響

5 轉(zhuǎn)染miR-146b-5p inhibitor后，膀胱癌BIU-87細(xì)胞中miR-146b-5p的表達(dá)水平下降

si-MALAT1+anti-miR-146b-5p組膀胱癌BIU-87細(xì)胞中miR-146b-5p的表達(dá)水平明顯低于si-MALAT1+anti-NC組(P<0.05),見圖5。

Figure 5. Down-regulation of miR-146b-5p expression in bladder cancer BIU-87 cells after transfection with miR-146b-5p inhibitor. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-MALAT1+anti-NC group..
圖5 轉(zhuǎn)染miR-146b-5p inhibitor后,膀胱癌細(xì)胞中miR-146b-5p的表達(dá)水平下調(diào)

6 下調(diào)miR-146b-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)敲減MALAT1表達(dá)對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞侵襲、遷移能力和EMT的影響

與si-MALAT1+anti-NC組相比，si-MALAT1+anti-miR-146b-5p組膀胱癌BIU-87細(xì)胞的侵襲和遷移數(shù)目增加，MMP-2和vimentin蛋白水平增加，E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05),見圖6。下調(diào)miR-146b-5p可以逆轉(zhuǎn)敲減MALAT1表達(dá)對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞侵襲、遷移能力和EMT的影響。

Figure 6. Reversal effects of miR-146b-5p inhibitor on invasion, migration abilities and the protein expression of MMP-2, vimentin and E-cadherin of bladder cancer BIU-87 cells induced by knock-down ofMALAT1expression. A: the results of Transwell assays for determining the invasion and migration abilities of bladder cancer BIU-87 cells; B: the results of Western blot for determining the effects of co-transfection of miR-146b-5p inhibitor and MALT1 siRNA on the protein expression of MMP-2, vimentin and E-cadherin in the BIU-87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-MALAT1+anti-NC group.
圖6 miR-146b-5p inhibitor逆轉(zhuǎn)敲減MALAT1表達(dá)對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞侵襲、遷移能力和MMP-2、vimentin和E-cadhe-rin蛋白表達(dá)的影響

討 論

LncRNA的長度大于200 nt，不能編碼蛋白質(zhì)，可以通過調(diào)控不同的基因表達(dá)參與生理和病理過程[8]。MALAT1又稱為NEAT2，是一個(gè)定位于染色體11q的LncRNA，MALAT1在哺乳動(dòng)物體內(nèi)十分保守，并且在不同組織臟器中的表達(dá)水平不同，其在肝臟和脊髓等組織中高表達(dá)，在食管組織及宮頸上皮組織中表達(dá)水平極低[9]。目前對(duì)于MALAT1的研究對(duì)象主要是腫瘤，在食管癌和宮頸癌等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)MALAT1表達(dá)量升高，并且其表達(dá)水平越高腫瘤轉(zhuǎn)移能力也越強(qiáng)，MALAT1在腫瘤中可能發(fā)揮類似癌基因的作用[10-12]。MALAT1具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的作用，MALAT1在卵巢癌和骨肉瘤等腫瘤EMT、侵襲等過程中發(fā)揮誘導(dǎo)功能[13-14]。在膀胱癌的研究報(bào)道中顯示，MALAT1高表達(dá)可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MALAT1 siRNA下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中MALAT1表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力降低，這與上述在其它腫瘤中的研究結(jié)果一致，均提示MALAT1可能是一種腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子。

我們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)敲減MALAT1表達(dá)后的膀胱癌細(xì)胞中的MMP-2蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞中vi-mentin蛋白水平也降低，而E-cadherin蛋白水平升高，說明MALAT1具有調(diào)控膀胱癌細(xì)胞中MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)的作用。MMP-2是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的基質(zhì)金屬蛋白酶，其可以將細(xì)胞外基質(zhì)降解，為腫瘤細(xì)胞的侵襲提供條件[16]。E-cadherin是上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物，vimentin是間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志物，vimentin表達(dá)上調(diào)和E-cadherin表達(dá)下調(diào)是細(xì)胞EMT的標(biāo)志，而腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生在腫瘤轉(zhuǎn)移早期[17]。我們的實(shí)驗(yàn)說明下調(diào)MALAT1可以抑制膀胱癌細(xì)胞EMT，下調(diào)MALAT1抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制可能與其抑制腫瘤細(xì)胞EMT和合成MMP-2有關(guān)。

LncRNA發(fā)揮生物學(xué)功能與調(diào)控下游靶基因的表達(dá)有關(guān)，在很多腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LncRNA可以通過靶向調(diào)控miRNA的表達(dá)發(fā)揮促癌或抑癌作用[18]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MALAT1與miR-146b-5p有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且證實(shí)膀胱癌細(xì)胞中MALAT1靶向負(fù)調(diào)控miR-146b-5p的表達(dá)。miR-146b-5p是一個(gè)在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)的miRNA，參與腫瘤細(xì)胞生長、分化和侵襲等，miR-146b-5p能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并且可以抑制細(xì)胞因子TGF-β1、MCP-1和TNF-α的表達(dá)[19-20]。在肝癌的研究報(bào)道中已經(jīng)表明，MALAT1能夠下調(diào)miR-146b-5p表達(dá)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移[7]。本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-146b-5p可以逆轉(zhuǎn)敲減MALAT1表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移和EMT的作用，提示敲減MALAT1表達(dá)可通過miR-146b-5p調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力和EMT，這與在上述肝癌細(xì)胞的研究結(jié)果相符合，說明MALAT1參與腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制與調(diào)控miR-146b-5p有關(guān)。

總而言之，下調(diào)MALAT1可促進(jìn)miR-146b-5p表達(dá)，抑制膀胱癌細(xì)胞EMT和合成MMP-2，進(jìn)而發(fā)揮抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移的作用。