朱 艷，梁子輝，任韞卓，吳 明，韓偉霞，肖 夏，杜春陽△

(河北醫(yī)科大學(xué) 1電鏡實(shí)驗(yàn)中心， 2外科總論與手術(shù)學(xué)教研室， 3病理學(xué)教研室， 河北 石家莊 050017)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥的腎臟表現(xiàn)，逐漸進(jìn)展可以導(dǎo)致終末期腎功能衰竭，主要表現(xiàn)為腎小管及間質(zhì)持續(xù)進(jìn)展的纖維化。腎小管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及膽固醇代謝紊亂在DN患者的腎小管及間質(zhì)纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[1]。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體(inflammasome)是介導(dǎo)機(jī)體免疫炎癥和細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，主要由NLRP3、銜接蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain)以及效應(yīng)蛋白caspase-1、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18組成，在受到相應(yīng)刺激后,通過NLRP3-ASC-caspase-1-IL-1β/IL-18軸的逐級(jí)活化,在包括2型糖尿病等多種炎癥免疫性疾病過程中都發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2]。膽固醇是NLRP3炎癥小體活化的主要刺激因素，低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)能夠激活巨噬細(xì)胞的NLRP3炎癥小體，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[3]。同時(shí)，膽固醇也是NLRP3炎癥小體活化后最主要的攻擊目標(biāo)。干擾NLRP3基因表達(dá)明顯延緩了載脂蛋白E缺乏小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，抑制了血管壁上的斑塊形成[4]。目前，有關(guān)NLRP3在糖尿病腎小管細(xì)胞膽固醇代謝中的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)將以NLRP3基因敲除(NLRP3-/-)小鼠為研究對(duì)象，從整體上觀察NLRP3對(duì)糖尿病小鼠腎組織炎癥及膽固醇代謝的影響，并初步探討相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

本研究以6～8周齡C57BL/6J背景的野生型(wild-type， WT)小鼠及NLRP3-/-小鼠為動(dòng)物模型，前者購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào)為2017-sw0139),后者由深圳華大基因公司采用TALEN技術(shù)構(gòu)建。所有小鼠均在本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室進(jìn)行飼養(yǎng)及繁殖，各項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理?xiàng)l例。

2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

兔抗小鼠NLRP3多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；兔抗小鼠固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(sterol regulatory element-binding protein-2, SREBP-2)、SREBP裂解活化蛋白(SREBP cleavage-activating protein, SCAP)、低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor, LDLR)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGCR)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)、ASC、caspase-1、肝X受體α(liver X receptor α, LXRα)和β-actin多克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗小鼠IL-1β、IL-18、p38 MAPK和p-p38 MAPK抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；油紅O購(gòu)自Sigma；Real-time PCR試劑購(gòu)自Promega；血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、空腹血糖(fasting blood-glucose，F(xiàn)BG)及24 h尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAE)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；總膽固醇(total cholesterol，TC)檢測(cè)試劑盒為上海榮盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1構(gòu)建動(dòng)物模型并分組 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：對(duì)照(WT)組、糖尿病(WT+STZ)組、NLRP3基因敲除(NKO)組和NLRP3基因敲除+糖尿病(NKO+STZ)組，每組10只小鼠，其中糖尿病小鼠的構(gòu)建采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ; 50 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)注射5 d；對(duì)照組小鼠在相同時(shí)間注射同體積的枸櫞酸鹽緩沖液。第5天晚上給小鼠禁食，第6天早8時(shí)測(cè)定小鼠的空腹血糖及尿糖情況，若血糖≥11.1 mmol/L且尿糖陽性者(+++～++++)確定為糖尿病模型。糖尿病模型建立后8周時(shí)用代謝籠收集各組小鼠24 h的尿液標(biāo)本，隨后處死小鼠，迅速股動(dòng)脈取血，靜置10 min后離心分離血清。切取雙側(cè)腎臟，取小米粒大小的腎皮質(zhì)迅速置于2.5%的戊二醛中固定，進(jìn)行后續(xù)的電鏡觀察；取部分腎皮質(zhì)置于4%的多聚甲醛中固定, 進(jìn)行光鏡觀察；取部分腎皮質(zhì)直接凍于-20 ℃用于油紅O染色；剩余腎組織置于液氮中進(jìn)行總蛋白質(zhì)的提取及檢測(cè)。

3.2血糖及小鼠腎功能的檢測(cè) 小鼠血糖測(cè)定采用羅氏血糖測(cè)試儀，取小鼠尾尖血進(jìn)行測(cè)試。腎功能各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，將工作液和血清或尿液樣本按100 ∶1的比例混合均勻后，在Rayto RT-9600半自動(dòng)生化儀上進(jìn)行分析。

3.3腎組織HE染色 4%多聚甲醛中固定24 h的各組小鼠的腎組織標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋后，切成2 μm厚的石蠟切片。切片脫蠟至水，進(jìn)行HE染色的切片直接蘇木素及伊紅染色，逐級(jí)梯度酒精脫水，二甲苯透明并中性樹膠封片。采用Olympus顯微鏡采集圖像。

3.4油紅O染色 凍存的腎組織標(biāo)本在冰凍切片機(jī)上切成8 μm厚的切片，鈣-甲醛固定液中充分固定20 min后，用提前配置好的油紅O染液進(jìn)行染色，時(shí)間為15 min，然后將切片傾斜，用50%的乙醇分化液輕輕沖洗切片進(jìn)行分化，隨后蒸餾水洗，蘇木素染色染核3～5 min，甘油明膠進(jìn)行封片。

3.5透射電鏡觀察 用預(yù)冷的2.5%戊二醛固定小鼠腎皮質(zhì)，組織塊大約1 mm×1 mm×1 mm 大小。隨后將腎組織依次進(jìn)行脫水、包埋和固化，將組織連續(xù)切片，應(yīng)用乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛進(jìn)行染色，在Hitachi H7500 透射電鏡下觀察每10 個(gè)同等放大倍數(shù)視野下腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)。

3.6腎組織甘油三酯及膽固醇含量的檢測(cè) 各組小鼠腎組織標(biāo)本各取100 mg制備組織勻漿；將氯仿與甲醇按照1 ∶1的比例混合好，取0.8 mL加入組織勻漿液中并充分混勻，室溫下靜置1 h，低溫離心機(jī)內(nèi)12 000 r/min離心10 min。將下層的脂質(zhì)小心抽取出并于4 ℃冰箱保存。按照試劑盒的操作步驟分別測(cè)定腎組織內(nèi)的膽固醇或甘油三酯含量。

3.7Western blot檢測(cè)各組小鼠腎組織蛋白質(zhì)的表達(dá) 各組小鼠腎組織標(biāo)本充分裂解提取組織蛋白。應(yīng)用BCA法測(cè)定各組蛋白質(zhì)的濃度，取裂解好的組織蛋白50 μg，經(jīng)SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；TBST緩沖液稍洗，將PVDF膜放于5%脫脂奶粉(TBST配制)中37 ℃封閉2 h，分別加入抗NLRP3、SCAP、SREBP-2、LDLR、HMGCR ABCA1、LXRα、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18、p38 MAPK、p-p38 MAPK和β-actin抗體，4 ℃冰箱過夜。用TBST緩沖液稀釋(5 000 ∶1)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 II 抗，37 ℃下孵育1.5 h；將ECL發(fā)光液均勻滴在PVDF膜上反應(yīng)1 min，在Odyssey FC成像系統(tǒng)中顯影。采用ImageJ軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NLRP3基因敲除對(duì)糖尿病小鼠的生化指標(biāo)及腎臟形態(tài)學(xué)改變的影響

與WT小鼠相比，糖尿病小鼠的FBG、BUN、SCr、TC及UAE均明顯升高，NLRP3基因敲除降低了糖尿病小鼠高水平的BUN、Scr及UAE(P<0.05或P<0.01)，但對(duì)FBG及TC的水平?jīng)]有影響，見圖1。與此同時(shí)，NLRP3基因敲除改善了糖尿病小鼠的腎組織形態(tài)學(xué)變化，抑制了高糖導(dǎo)致的腎小球體積增大、系膜細(xì)胞增生及系膜基質(zhì)的沉積，減輕了腎小管上皮細(xì)胞的空泡變性，見圖2。

Figure 1. The changes of blood glucose, blood urea nitrogen, serum creatinine, triglyceride, total cholesterol and urine albumin excretion in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsWT group;#P<0.05,##P<0.01vsWT+STZ group.
圖1 各組小鼠生化指標(biāo)的變化

Figure 2. Sections of HE staining in each group (×400).
圖2 各組小鼠腎組織HE染色的觀察

2 NLRP3基因敲除對(duì)糖尿病小鼠腎臟NLRP3炎癥小體及炎癥反應(yīng)的影響

糖尿病小鼠腎組織中NLRP3、ASC和caspase-1 p10的蛋白表達(dá)明顯升高，同時(shí)NLRP3炎癥小體下游效應(yīng)分子cleaved IL-1β及IL-18的蛋白水平也顯著增加；NLRP3基因敲除后上述蛋白的水平均顯著下降(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The effects ofNLRP3knockout on the protein levels of NLRP3, ASC, caspase-1 p10, cleaved IL-1β and IL-18 in the diabe-tic mice were determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsWT+STZ group.
圖3NLRP3基因敲除對(duì)糖尿病小鼠腎組織NLRP3，ASC、caspase-1 p10、cleaved IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)的影響

3 NLRP3基因敲除對(duì)糖尿病小鼠腎組織脂質(zhì)含量的影響

油紅O染色及透射電鏡結(jié)果顯示，糖尿病小鼠腎小管細(xì)胞內(nèi)脂滴大量沉積；而NLRP3基因敲除顯著抑制了糖尿病小鼠腎小管細(xì)胞內(nèi)的脂滴沉積，見圖4A。同時(shí)，NLRP3基因敲除也顯著緩解了糖尿病小鼠腎組織內(nèi)的高水平甘油三酯和膽固醇含量(P<0.01)，見圖4B、C。

Figure 4. The effects ofNLRP3knockout on lipid droplet formation (A) and content of triglyceride (B) and cholesterol (C) in diabetic mice. The lipid droplet formation in renal tissues was observed by electron microscopy (×15 000) and oil red O staining (scale bar=50 μm). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsWT+STZ group.
圖4NLRP3基因敲除對(duì)糖尿病小鼠腎組織脂滴形成及脂質(zhì)含量的影響

4 NLRP3基因敲除對(duì)糖尿病小鼠腎臟膽固醇代謝的影響

與WT小鼠相比，糖尿病小鼠腎組織中參與膽固醇攝取和合成的SCAP、SREBP-2、LDLR和HMGCR的蛋白水平明顯升高，而介導(dǎo)膽固醇流出的LXRα和ABCA1表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；NLRP3基因敲除抑制了SCAP、SREBP-2、LDLR和HMGCR的高表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了LXRα和ABCA1的表達(dá)(P<0.01)，見圖5。

Figure 5. The effects ofNLRP3knockout on the protein expression of SCAP, SREBP-2, LDLR, HMGCR, ABCA1 and LXRα in diabetic mice were determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsWT+STZ group.
圖5NLRP3基因敲除對(duì)糖尿病小鼠腎組織SCAP、SREBP-2、LDLR、HMGCR、ABCA1和LXRα 蛋白表達(dá)的影響

5 NLRP3基因敲除對(duì)糖尿病小鼠腎組織p38 MAPK活化的影響

與WT小鼠相比，糖尿病小鼠腎組織中p38 MAPK的磷酸化水平升高；敲除NLRP3基因抑制了糖尿病小鼠腎組織p38 MAPK的磷酸化(P<0.01)，見圖6。

Figure 6. The effects ofNLRP3knockout on phosphorylation of p38 MAPK in diabetic mice were determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsWT+STZ group.
圖6NLRP3基因敲除對(duì)糖尿病小鼠腎組織p38 MAPK磷酸化的影響

討 論

DN發(fā)展至晚期的主要病理表現(xiàn)為腎小管及間質(zhì)的持續(xù)進(jìn)展性纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，抑制或敲除NLRP3的表達(dá)能夠顯著抑制糖尿病小鼠的腎組織損傷及間質(zhì)纖維化[5-6]。腎組織的無菌性炎癥反應(yīng)是造成DN間質(zhì)纖維化的重要原因之一，抑制炎癥反應(yīng)可以有效緩解腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。也有研究發(fā)現(xiàn)，SO2衍生物通過活化NLRP3炎癥小體促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的炎癥發(fā)生[7]。在本研究中，我們?cè)谇贸薔LRP3基因的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下的腎組織炎癥因子IL-1β和IL-18的表達(dá)顯著下調(diào)，同時(shí)NLRP3炎癥小體的組成成分ASC及caspase-1的表達(dá)也顯著減少，提示NLRP3在糖尿病腎組織的炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。

多種因素可以誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化，其中膽固醇是重要的誘導(dǎo)因素。細(xì)胞內(nèi)沉積的膽固醇激活NLRP3炎癥小體后并通過釋放炎癥因子IL-1β等加重組織或細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[8]。據(jù)報(bào)道膽固醇同時(shí)也是疾病狀態(tài)下NLRP3炎癥小體活化后最主要的攻擊目標(biāo)，NLRP3的小分子抑制劑能夠明顯減少非酒精性脂肪肝小鼠肝臟總膽固醇、甘油三酯及游離脂肪酸的含量[9]。高脂飲食條件下，NLRP3-/-小鼠腎組織沒有表現(xiàn)明顯的膽固醇及磷脂的沉積[10]。本研究中，糖尿病小鼠模型腎組織內(nèi)NLRP3蛋白表達(dá)異常增加，敲除NLRP3后小鼠的腎功能有所改善；同時(shí)腎小管細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)明顯減少，甘油三酯和膽固醇含量下降，但敲除NLRP3對(duì)糖尿病狀態(tài)下小鼠血中總膽固醇的含量沒有影響。以上研究提示NLRP3可能是通過改善腎組織自身的膽固醇代謝來參與糖尿病腎組織脂質(zhì)沉積過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：高糖能夠?qū)е麦w外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞膽固醇蓄積，天然抗氧化劑花青素通過誘導(dǎo)ABCA1表達(dá)增加促進(jìn)了膽固醇外流，從而抑制了高糖誘導(dǎo)的膽固醇沉積[11]。Guo等[12]證實(shí)NLRP3炎癥小體的激活與膽固醇合成的主轉(zhuǎn)錄因子SREBP-2的成熟密切相關(guān)，活化的NLRP3進(jìn)一步與膽固醇體內(nèi)平衡的調(diào)節(jié)因子SCAP和SREBP2形成復(fù)合體，限制了巨噬細(xì)胞膽固醇的蓄積。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖情況下LDLR、HMGCR、SCAP和SREBP-2在腎組織內(nèi)的蛋白的表達(dá)顯著增加；同樣介導(dǎo)膽固醇流出的LXRα和ABCA1的表達(dá)下調(diào)。敲除NLRP3下調(diào)了腎組織SCAP、SREBP-2、LDLR和HMGCR的表達(dá)，上調(diào)了LXRα和ABCA1的表達(dá)。

p38 MAPK是重要的信號(hào)分子，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，參與調(diào)控多種細(xì)胞代謝過程。研究顯示，利拉魯肽改善了高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的大鼠海馬區(qū)域的炎癥性損傷與其對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路的抑制有關(guān)[13]。p38 MAPK信號(hào)通路的激活還參與了肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積過程[14]。在本研究中，糖尿病小鼠腎組織的p38 MAPK磷酸化水平顯著升高，敲除NLRP3后抑制了p38 MAPK的磷酸化；同時(shí)腎組織的炎癥及脂質(zhì)沉積都得到了顯著改善，以上結(jié)果提示NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在糖尿病腎損傷及脂代謝異常中發(fā)揮重要作用，這種作用可能是部分通過調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路活化實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在糖尿病腎損傷及脂代謝異常中發(fā)揮重要作用，其中p38 MAPK信號(hào)通路的活化可能是NLRP3發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號(hào)因子。NLRP3炎癥小體有可能成為糖尿病腎組織損傷的防治靶點(diǎn)。