亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        Drp1在高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用研究*

        2020-02-06 03:06:38吳清蕊練飛鴻鄺素娟吳飛龍張夢(mèng)珍麥麗萍林秋雄單志新鄧春玉
        中國(guó)病理生理雜志 2020年1期
        關(guān)鍵詞:高糖磷酸化心肌細(xì)胞

        吳清蕊,練飛鴻,饒 芳,鄺素娟,楊 慧,吳飛龍,張夢(mèng)珍, 麥麗萍,林秋雄,單志新,楊 敏,鄧春玉△

        (1華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州 510006; 2廣東省心血管病研究所臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部, 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 廣東 廣州 510080)

        糖尿病(diabetes mellitus, DM)是胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足,以高血糖和高血脂為特征的代謝紊亂綜合征,糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是其常見(jiàn)的心臟并發(fā)癥[1],是DM引起心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌廣泛局灶性壞死,其病理變化在細(xì)胞水平主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大,而在亞細(xì)胞水平主要表現(xiàn)為線粒體破損、較小線粒體數(shù)量增多[2],具體的發(fā)病機(jī)制及病理過(guò)程目前尚未完全清楚。研究表明,線粒體功能異常是心肌肥厚發(fā)生的主要機(jī)制[3],但線粒體分裂(mitochon-drial fission)異常與糖尿病性心肌肥厚的關(guān)系少見(jiàn)報(bào)道。也有研究顯示,線粒體動(dòng)力學(xué)失衡與許多疾病有密切關(guān)系,發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白(dynamin-related protein 1,Drp1)在Ser616位點(diǎn)磷酸化水平增加,Ser637位點(diǎn)磷酸化水平降低可以促進(jìn)線粒體分裂[4-8]。因此,我們推測(cè)Drp1磷酸化水平變化介導(dǎo)的線粒體分裂增加可能參與了糖尿病心肌肥厚的發(fā)生,分別在細(xì)胞水平和分子水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,探討線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白Drp1的磷酸化水平在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型中的表達(dá)變化及其作用機(jī)制。

        材 料 和 方 法

        1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        出生1~3 d的SD乳大鼠,雌雄不限,SPF級(jí),由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2016-0041,質(zhì)量檢測(cè)單位為廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)所。

        2 主要試劑

        兔抗心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)單克隆抗體購(gòu)自Bioworld Technology;鼠抗Drp1單克隆抗體、兔抗p-Drp1(Ser616)單克隆抗體和兔抗p-Drp1(Ser637)單克隆抗體購(gòu)自CST;兔抗α-微管蛋白(α-tubulin)單克隆抗體購(gòu)自Proteintech;脫脂奶粉購(gòu)自BD;4×SDS 上樣緩沖液、線粒體分裂抑制劑1(mitochondrial division inhibitor 1, Mdivi-1)和4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)購(gòu)自Sigma;聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜和放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(radio immunoprecipitation assay, RIPA)細(xì)胞裂解液購(gòu)自Millipore;麥胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)購(gòu)自武漢谷歌生物公司;線粒體膜電位(mitochon-drial membrane potential, MMP)檢測(cè)試劑盒(JC-1)和BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司;5-溴-2′-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine, BrdU)購(gòu)自Selleck;DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco;磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline,PBS)購(gòu)自武漢博士德公司。

        3 主要方法

        3.1細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù) 用酶解分離法將1~3 d的SD乳大鼠心臟消化分離成單個(gè)細(xì)胞,根據(jù)心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的差速貼壁,分離心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,用含雙抗和10%胎牛血清的DMEM(含5.5 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)液將心肌細(xì)胞懸液重懸,加入BrdU抑制成纖維細(xì)胞增殖,置于包被鼠尾膠原的6孔板中,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h(其中24 h換液一次)后,換含不同糖濃度的無(wú)BrdU的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至72 h。將培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞分成6組:對(duì)照(control; 5.5 mmol/L葡萄糖)組、高滲透壓(hyperosmosis,HM;33 mmol/L甘露醇)組、DMSO組、高糖(high glucose, HG;33 mmol/L葡萄糖)組、Mdivi-1(10 μmol/L)組和HG+Mdivi-1組(10 μmol/L Mdivi-1預(yù)處理3 h后再換成含33 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h)。

        3.2SD乳大鼠原代心肌細(xì)胞WGA染色和細(xì)胞表面積計(jì)算 1~3 d的SD乳大鼠原代心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)48 h后,高糖組用含33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至72 h,PBS漂洗2次,每次5min,用4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)固定細(xì)胞15 min后,用PBS漂洗2次,每次5 min,根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書加入WGA-Alexa Fluor 488,室溫避光孵育10 min后,用PBS漂洗2次,每次5 min, 滴加DAPI染核及封片,激光共聚焦掃描顯微鏡采集圖片,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量心肌細(xì)胞的表面積。

        3.3JC-1檢測(cè) MMP 將原代心肌細(xì)胞分為control組、HM組和HG組,高糖培養(yǎng)72 h后換液,根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書加入JC-1染料(10 mg/L)避光孵育15 min,PBS漂洗2次后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降,用ImageJ 軟件對(duì)線粒體膜電位熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析,通過(guò)測(cè)取圖片中的紅綠熒光的比值,記錄作為線粒體膜電位的原始數(shù)據(jù)。

        3.4Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量的變化 提取心肌細(xì)胞總蛋白:細(xì)胞收板后用PBS漂洗2次,加入含有蛋白酶抑制劑的中性裂解液冰上裂解30 min,用細(xì)胞刮促進(jìn)細(xì)胞充分裂解,吸取到EP管靜置、12 000 r/min離心15 min,上清即為細(xì)胞總蛋白。BCA 法進(jìn)行蛋白定量。用裂解液和上樣緩沖液(4 ×)將各樣品配至蛋白量為20 μg,100 ℃變性10 min,進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂奶粉將膜浸泡常溫置搖床上封閉1 h,I抗(1 ∶1 000稀釋)4 ℃搖床孵育過(guò)夜。第2天用TBST洗膜3次,每次5 min,然后室溫?fù)u床孵育II抗1 h左右(II抗1 ∶5 000稀釋于含5% 脫脂奶粉的TBST)。TBST洗膜3次,每次5 min。用ECL試劑盒顯影蛋白條帶,ImageJ圖像分析軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值,取目的條帶的灰度值與內(nèi)參照的灰度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

        4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用GraphPad Prism 5將統(tǒng)計(jì)結(jié)果繪制成柱形圖,計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)方式表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 高糖誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞肥大

        與control組及HM組相比,HG組ANP的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),心肌細(xì)胞表面積也顯著增加(P<0.01);control組和HM組之間無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)圖1。

        Figure 1. High glucose (HG) induced hypertrophy of neonatal rat cardiomyocytes. A: the protein expression of ANP in the neonatal rat cardiomyocytes (n=3); B: immunofluorescence staining (WGA staining) showed the size of the neonatal rat cardiomyocytes (scale bar=50 μm; 50 cells were quantified in each group). Mean±SEM.**P<0.01vsother groups.
        圖1 高糖誘導(dǎo)乳大鼠心肌細(xì)胞肥大

        2 高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體膜電位降低

        與control組及HM組相比,HG組的心肌細(xì)胞MMP顯著降低(P<0.01);control組和HM組之間無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)圖2。

        Figure 2. High glucose (HG) induced dissipation of MMP in neonatal rat cardiomyocytes. JC-1 aggregates (red) indicate intact MMP, while JC-1 monomers (green) indicate dissipation of MMP. The scale bar=50 μm. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsother groups.
        圖2 高糖誘導(dǎo)線粒體膜電位降低

        3 高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體分裂增加

        與control組及HM組相比,HG組p-Drp1 (Ser616)水平顯著升高(P<0.05),p-Drp1(Ser637)水平顯著減少(P<0.05),Drp1總蛋白水平無(wú)顯著變化(P>0.05);control組和HM組之間無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)圖3。

        Figure 3. High glucose (HG) induced increase in mitochondrial fission. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsother groups.
        圖3 高糖誘導(dǎo)線粒體分裂增加

        4 線粒體分裂抑制劑Mdivi-1抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大

        與control組相比,HG組ANP和p-Drp1(Ser616)水平顯著升高(P<0.05),而p-Drp1(Ser637)水平顯著降低(P<0.05);與HG組相比,高糖+Mdivi-1組ANP和p-Drp1(Ser616)水平顯著降低(P<0.05),而p-Drp1(Ser637)水平顯著升高(P<0.05),Drp1總蛋白水平無(wú)顯著變化(P>0.05);control組、HM組、DMSO組和Mdivic-1組之間無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)圖4。

        Figure 4. Mdivi-1 blocked high glucose (HG)-induced cardiomyocyte hypertrophy. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.
        圖4 Mdivi-1阻斷高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大

        討 論

        本研究結(jié)果表明,乳大鼠心肌細(xì)胞Drp1蛋白Ser616位點(diǎn)的磷酸化增加而Ser637位點(diǎn)的磷酸化減少導(dǎo)致的線粒體分裂增加,促進(jìn)了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,抑制Drp1可以顯著緩解高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,提示DM導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體分裂增加可能是心肌肥厚的重要因素。

        高血糖是DCM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9],然而,其潛在機(jī)制尚未得到充分闡明。以往研究應(yīng)用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞建立DM代謝損傷細(xì)胞模型[10-11],探索高血糖導(dǎo)致DCM的內(nèi)在機(jī)制[12],但高糖培養(yǎng)液的含糖濃度及干預(yù)時(shí)長(zhǎng)不定。為了選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)濃度及干預(yù)時(shí)長(zhǎng),預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示,相比對(duì)照組,葡萄糖濃度為33 mmol/L、刺激72 h時(shí)ANP的表達(dá)水平穩(wěn)定增加,細(xì)胞的表面積顯著增加。因此本項(xiàng)工作選擇該細(xì)胞模型,對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探索。

        線粒體功能障礙在調(diào)節(jié)DM患者糖脂代謝和心功能障礙中擔(dān)任著重要角色[13]。據(jù)此我們提出假說(shuō):高糖通過(guò)促進(jìn)線粒體功能障礙誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大,而線粒體功能可以通過(guò)檢測(cè)MMP的變化來(lái)評(píng)價(jià)[14-15]。因此,我們分別檢測(cè)了不同組心肌細(xì)胞的MMP,與前人研究結(jié)果[14-15]一致,高糖誘導(dǎo)乳大鼠原代心肌細(xì)胞MMP降低,提示高糖作用下心肌細(xì)胞出現(xiàn)線粒體功能障礙。

        目前認(rèn)為線粒體動(dòng)力學(xué)異常參與多種心血管疾病的過(guò)程[16],重建線粒體融合-分裂平衡可能為心血管疾病的防治提供新的參考資料[17]。由此,我們?cè)O(shè)想線粒體分裂異常參與了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的過(guò)程。線粒體分裂主要受胞漿Drp1調(diào)控,Drp1的Ser616 位點(diǎn)磷酸化水平升高或Ser637 位點(diǎn)磷酸化水平降低都能促進(jìn)線粒體分裂增加[18]。本研究結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的p-Drp1(s616)水平升高,而p-Drp1(Ser637)水平降低,表明高糖導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體分裂增加,提示線粒體分裂增加可能促進(jìn)了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,為了進(jìn)一步證明該結(jié)論,我們加入線粒體分裂抑制劑Mdivi-1對(duì)原代心肌細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理3 h,然后換高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h。通過(guò)量效實(shí)驗(yàn)顯示,Mdivi-1干預(yù)濃度為1 μmol/L、3 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L均可以顯著逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的ANP表達(dá)水平增加,據(jù)此本項(xiàng)工作后續(xù)研究Mdivi-1的作用機(jī)制采用的干預(yù)濃度為10 μmol/L。已有研究表明,Mdivi-1是線粒體分裂的特異性阻斷劑,通過(guò)抑制Drp1的GTP酶活性抑制線粒體分裂[19],而Drp1活性增加主要與Ser616位點(diǎn)磷酸化增加,Ser637位點(diǎn)磷酸化水平降低有關(guān)[20]。因此為了驗(yàn)證線粒體分裂增加促進(jìn)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大這一假說(shuō),需首先明確本研究中Mdivi-1抑制線粒體分裂的內(nèi)在機(jī)制,研究結(jié)果明確了Mdivi-1阻斷高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的內(nèi)在機(jī)制是通過(guò)降低Drp1在Ser616位點(diǎn)磷酸化水平同時(shí)促進(jìn)Ser637位點(diǎn)的磷酸化,抑制其GTP酶活性,從而降低線粒體分裂,最終緩解高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,進(jìn)一步證明了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大與線粒體分裂增加密切相關(guān)。

        綜上所述,本研究通過(guò)原代分離培養(yǎng)乳大鼠心肌細(xì)胞,建立高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型,在細(xì)胞和蛋白分子水平上,證實(shí)了高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制,與Drp1在Ser616位點(diǎn)磷酸化水平升高、Ser637位點(diǎn)磷酸化水平降低導(dǎo)致的線粒體分裂增加有關(guān)。

        猜你喜歡
        高糖磷酸化心肌細(xì)胞
        左歸降糖舒心方對(duì)糖尿病心肌病MKR鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響
        活血解毒方對(duì)缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞凋亡的影響
        ITSN1蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
        葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用
        中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:04
        丹紅注射液對(duì)高糖引起腹膜間皮細(xì)胞損傷的作用
        中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:21
        心肌細(xì)胞慢性缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的研究進(jìn)展
        槲皮素通過(guò)抑制蛋白酶體活性減輕心肌細(xì)胞肥大
        MAPK抑制因子對(duì)HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核轉(zhuǎn)位的影響
        張掖市甜菜高產(chǎn)高糖栽培技術(shù)
        大黃素對(duì)高糖培養(yǎng)的GMC增殖、FN表達(dá)及p38MAPK的影響
        精品人妻码一区二区三区剧情| 亚洲国产精品自产拍久久蜜AV| 久久久国产精品ⅤA麻豆百度| 亚洲av毛片在线播放| 亚洲av成人片色在线观看 | 亚洲欧美另类精品久久久| 亚洲国产精品成人av| 国产精品成人亚洲一区| 精品9e精品视频在线观看| 日韩在线不卡免费视频| 亚洲黄色一插一抽动态图在线看| 青青草免费在线爽视频| 中文字幕av免费专区| 最新国产日韩AV线| 日本一区二区久久精品亚洲中文无| 偷拍美女上厕所一区二区三区| s级爆乳玩具酱国产vip皮裤| 国产麻豆精品一区二区三区v视界| 日韩精品视频在线一二三| 澳门蜜桃av成人av| 精品乱码久久久久久久| 免费人成在线观看播放国产| 中文字幕人妻乱码在线| 国产99久久久国产精品~~牛| 丰满少妇大力进入av亚洲| 东京热加勒比在线观看| 美女和男人一起插插插| 亚洲国产一区二区三区在线观看 | 各种少妇正面着bbw撒尿视频| 国产一品道av在线一二三区| 成在线人免费视频播放| 国产精品主播在线一区二区| 久久亚洲精品11p| 亚洲综合日韩中文字幕| 男女互舔动态视频在线观看 | a级毛片100部免费看| 日韩在线精品在线观看| 国产麻豆剧传媒精品国产av| 亚洲av综合a色av中文| 91香蕉视频网| 精品国产亚洲av久一区二区三区|