雷旭琴，孫宇寧，宋 婕，李曉娜，陳維毅，楊繼忠

(1.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原 030024；2.山西省眼科醫(yī)院 準(zhǔn)分子激光室，太原 030024)

準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù)(LASIK)等角膜屈光手術(shù)是矯正近視的主要方法，術(shù)后角膜的生物力學(xué)性能下降，在眼內(nèi)壓的作用下，角膜厚度變化越大，其所受的張力變化就越大，當(dāng)張力改變超過了角膜床的承受能力，角膜發(fā)生變形，可引發(fā)繼發(fā)性圓錐角膜等術(shù)后并發(fā)癥。力學(xué)因素在圓錐角膜發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用[1]。把角膜組織的纖維看成各向異性材料，通過有限元分析發(fā)現(xiàn)屈光手術(shù)后角膜的最大應(yīng)力可增加20%[2].基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)組分的蛋白酶家族，在細(xì)胞增殖、遷移和粘合等過程中發(fā)揮重要作用。MMPs活性升高導(dǎo)致膠原降解異常是圓錐角膜等角膜擴(kuò)張疾病發(fā)生的可能機(jī)制之一[3]。研究表明，機(jī)械拉伸能后誘導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞中MMPs的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，進(jìn)而參與圓錐角膜等術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[4]。

水通道蛋白(AQPs)是一類介導(dǎo)水分子轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜蛋白。在眼組織中，AQPs的分布與眼內(nèi)房水的分泌和循環(huán)密切相關(guān)，在角膜和晶狀體透明度的維持、淚液的分泌等生理過程發(fā)揮重要的功能，與角膜變性水腫、白內(nèi)障、青光眼、干燥綜合征等許多眼部疾病的發(fā)生密切相關(guān)。多數(shù)AQPs在角膜中均有表達(dá)，其中AQP1的表達(dá)量最高。對(duì)AQP1基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)AQP1與角膜基質(zhì)厚度密切相關(guān)[5]。研究表明，AQP1可參與MMPs的表達(dá)調(diào)控。抑制AQP1后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)降低，遷移能力降低[6]。在肺癌細(xì)胞系LTEP-A2和LLC中, 使用siRNA降低AQP1的表達(dá)能夠下調(diào)細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)水平[7]。沉默AQP1能夠降低視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中MMP2、MMP9的蛋白水平，抑制PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移[8]。在對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，AQP1分別與β-catenin、FAK共沉淀，過表達(dá)AQP可以通過激活Wnt信號(hào)通路和FAK信號(hào)通路誘導(dǎo)MMP2的表達(dá)。

力刺激介導(dǎo)的MMP2的表達(dá)是圓錐角膜等屈光手術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵因素之一，但其分子機(jī)制還不清楚。本研究對(duì)體外培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械拉伸處理，模擬屈光術(shù)后角膜的受力變化，分析拉伸處理后細(xì)胞中AQP1及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化，探討AQP1在機(jī)械拉伸誘導(dǎo)角膜細(xì)胞中MMP2表達(dá)過程中的作用，為揭示角膜細(xì)胞響應(yīng)力刺激的分子機(jī)制及研究屈光手術(shù)后圓錐角膜等并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)理提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

原代人角膜基質(zhì)細(xì)胞購買自ScienCell公司(USA)，采用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(fibroblast medium,FM)(包含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清，體積分?jǐn)?shù)1%成纖維細(xì)胞生長因子，體積分?jǐn)?shù)1%青霉素/鏈霉素)(ScienCell，USA)在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長至90%融合后進(jìn)行后續(xù)處理。

周期性力學(xué)加載：將角膜細(xì)胞以個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到裱襯有Ⅰ型膠原蛋白的BioFlex硅膠底六孔培養(yǎng)板上，長到90%融合后，更換為無血清和生長因子的FM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，饑餓處理6 h后采用Flexcell-4000拉伸加載系統(tǒng)(Flexcell International，Mckeesport，PA，USA)進(jìn)行力學(xué)加載，加載條件為：正弦波，0.5 Hz頻率，15%拉伸幅度。分別于加載0，1，4，6，8 h后收取細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，以相應(yīng)培養(yǎng)條件下未拉伸處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。

Ca2+螯合劑處理：細(xì)胞長到90%融合后，更換為FM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加入10 μmol/L Ca2+螯合劑BAPTA(Sigma，USA)，培養(yǎng)6 h或按照上述加載條件拉伸處理6 h后進(jìn)行RNA提取或環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量測(cè)定。

1.2 基因表達(dá)分析

收集的細(xì)胞用PBS洗滌后加入RNA裂解液，采用EastepSuper總RNA提取試劑盒(Promega，上海)提取總RNA，具體步驟按照說明書進(jìn)行。以提取的總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，大連)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.根據(jù)GenBank中的序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物并由上海生工生物工程公司合成，引物名稱及序列如表1所示。以管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，以合成的cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(SYBR染料法)檢測(cè)AQP1、ARHGEF2、Wnt11、MMP2基因的表達(dá)。20 μL PCR體系包含10 μL SYBR Green(Takara，大連)，0.4 μL ROX，上下游引物各0.2 μL，2 μL cDNA，6.8 μL H2O.熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；(95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸并收集熒光信號(hào)30 s)，40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量法對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行分析。以對(duì)照組中的表達(dá)量為1，獲得處理組中各基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。

1.3 cAMP含量測(cè)定

用細(xì)胞刮收取細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入150 μL的PBS溶液，多次反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎，1 500 g離心10 min，吸取上清，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)進(jìn)行cAMP含量分析。檢測(cè)過程按照cAMP ELISA試劑盒(Elabscience，武漢)說明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀(Thermomax，CA)測(cè)定反應(yīng)液在450 nm波長處的吸光值。將cAMP標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其在450 nm波長處的吸光值(OD450)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，cAMP濃度與OD450成反比，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中cAMP的濃度。以未處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，分析處理組細(xì)胞中cAMP的相對(duì)含量。

1.4 熒光顯微鏡檢測(cè)Ca2+濃度變化

采用Fluo-3熒光探針(KeyGEN，南京)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度變化。在拉伸處理6 h后的角膜基質(zhì)細(xì)胞與未處理的對(duì)照組角膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入0.1 μmol/L的Fluo-3-DMSO溶液于37 ℃避光孵育1 h，孵育結(jié)束后用PBS清洗兩次后熒光倒置顯微鏡鏡檢拍照，激發(fā)波長為488 nm.

1.5 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±SD表示，通過SPSS 17.0軟件采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.05表明有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 機(jī)械拉伸處理后AQP1及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的變化

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)機(jī)械拉伸處理不同時(shí)間對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞中AQP1及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因ARHGEF2、Wnt11的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，機(jī)械拉伸1，4，6，8 h后AQP1的表達(dá)均有所上升，分別是未處理對(duì)照組的2.0，1.5，12.0，1.5倍(p<0.05)，機(jī)械拉伸處理6 h能夠顯著誘導(dǎo)人角膜基質(zhì)細(xì)胞中AQP1的表達(dá)。此外，機(jī)械拉伸處理后細(xì)胞中AQP下游FAK信號(hào)途徑相關(guān)基因ARHGEF以及Wnt信號(hào)途徑基因Wnt11的表達(dá)較未拉伸處理的對(duì)照組均有顯著的升高(p<0.05)，其中機(jī)械拉伸處理6 h時(shí)表達(dá)量最高，分別為對(duì)照組的2倍和8倍(p<0.05).

2.2 機(jī)械拉伸對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

采用Fluo-3熒光探針檢測(cè)機(jī)械拉伸處理后角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，結(jié)果如圖2所示，機(jī)械拉伸后的細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光信號(hào)強(qiáng)于未拉伸對(duì)照組細(xì)胞，表明機(jī)械拉伸能夠誘導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。

2.3 Ca2+在機(jī)械拉伸介導(dǎo)的AQP1及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)中的作用

通過加入10 μmol/L Ca2+螯合劑BAPTA降低角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，結(jié)合機(jī)械拉伸處理(6 h)，檢測(cè)Ca2+對(duì)機(jī)械拉伸介導(dǎo)的AQP1，ARHGEF2，Wnt11，MMP2基因表達(dá)的作用。如圖3所示，機(jī)械拉伸能夠顯著誘導(dǎo)角膜細(xì)胞中AQP1，ARHGEF2，Wnt11，MMP2基因的表達(dá)(p<0.05).與單獨(dú)機(jī)械拉伸處理組相比，BAPTA結(jié)合拉伸處理組角膜基質(zhì)細(xì)胞中AQP1，ARHGEF2，Wnt11，MMP2基因的表達(dá)具有顯著的降低，分別為單獨(dú)拉伸組的0.32，0.63，0.16，0.80倍(p<0.05)，表明Ca2+螯合劑BAPTA能夠顯著降低機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的AQP1，ARHGEF2，Wnt11，MMP2基因的表達(dá)(p<0.05).

*代表與0 h靜態(tài)對(duì)照組有顯著性差異，p<0.05

圖2 角膜基質(zhì)細(xì)胞中Ca2+的含量

2.4 機(jī)械拉伸對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞中cAMP含量的影響

采用競(jìng)爭ELISA法檢測(cè)角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量，結(jié)果如圖4所示，機(jī)械拉伸處理6 h后的角膜基質(zhì)細(xì)胞中cAMP的含量是未拉伸對(duì)照組的1.6倍(p<0.05).與單獨(dú)拉伸處理組相比，BAPTA結(jié)合拉伸處理后角膜基質(zhì)細(xì)胞中cAMP的含量顯著下降，為拉伸組的0.75倍(p<0.05)，表明機(jī)械拉伸能夠提高角膜基質(zhì)細(xì)胞中cAMP的含量，加入Ca2+螯合劑后cAMP的含量降低。

3 討論

力學(xué)因素在LASIK術(shù)后圓錐角膜等并發(fā)癥的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用。LASIK手術(shù)使角膜周邊基質(zhì)板層的張力降低，角膜拮抗膨脹壓的能力隨之降低，角膜周邊基質(zhì)體積急性擴(kuò)張，使受損部位的組織受到更大的牽拉，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)角膜變形[1-2,9-11]。角膜是典型的承載組織，角膜的基質(zhì)層約占角膜總厚度的90%，富含膠原纖維，承擔(dān)角膜的主要抗張強(qiáng)度。術(shù)后圓錐角膜的發(fā)生可能與膠原數(shù)量減少導(dǎo)致角膜抗張強(qiáng)度降低有關(guān)。正常狀態(tài)下，膠原的合成和降解處于代謝平衡狀態(tài)。LASIK手術(shù)后角膜受力發(fā)生變化，MMP2等膠原酶表達(dá)升高使得膠原的降解增加，角膜的抗張強(qiáng)度降低，在眼內(nèi)壓作用下角膜發(fā)生嚴(yán)重變形進(jìn)而誘發(fā)圓錐角膜等術(shù)后并發(fā)癥。前期研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械拉伸能夠通過ERK1/2信號(hào)途徑誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的角膜細(xì)胞中MMP2基因及蛋白的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)降解[4]。AQP1與許多眼部疾病的發(fā)生密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，AQP1與角膜基質(zhì)層厚度密切相關(guān)，AQP1參與角膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移，促進(jìn)角膜的損傷修復(fù)，但其在術(shù)后圓錐角膜發(fā)生中的作用還有待進(jìn)一步研究。過表達(dá)AQP1可通過激活下游的FAK通路和Wnt通路來促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移。對(duì)癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，AQP1的表達(dá)與MMP2的表達(dá)呈正相關(guān)[7]。通過已有研究推測(cè)，機(jī)械拉伸可能通過誘導(dǎo)AQP1及下游FAK、Wnt信號(hào)途徑參與MMP2的表達(dá)調(diào)控，調(diào)節(jié)膠原的代謝，進(jìn)而在術(shù)后圓錐角膜病變過程中發(fā)揮作用。

*代表與對(duì)照組有顯著差異，p<0.05；#代表BAPTA結(jié)合拉伸處理組與單獨(dú)拉伸組有顯著差異，p<0.05

*代表與對(duì)照組有顯著差異，p<0.05；#代表BAPTA結(jié)合拉伸處理組與單獨(dú)拉伸組有顯著差異，p<0.05

本研究利用機(jī)械拉伸處理體外培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞，模擬角膜屈光手術(shù)后的受力環(huán)境，檢測(cè)角膜基質(zhì)細(xì)胞中AQP1的表達(dá)變化。結(jié)果表明，周期性機(jī)械拉伸能夠顯著誘導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞中AQP1的表達(dá)。機(jī)械通氣能夠增加大鼠肺中AQP1基因的表達(dá)[12]。采用Flexcell系統(tǒng)對(duì)體外培養(yǎng)的小梁網(wǎng)細(xì)胞進(jìn)行拉伸，結(jié)果顯示，10%和20%拉伸幅度均可誘導(dǎo)細(xì)胞中AQP1的表達(dá)[13]，與本研究結(jié)果一致。此外，本研究進(jìn)一步分析了機(jī)械拉伸對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞中AQP1下游FAK、Wnt信號(hào)途徑相關(guān)的基因的表達(dá)，探討機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的AQP1的表達(dá)對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞中MMP2調(diào)控的作用機(jī)制。ARHGEF2，又稱GEF-H1，是鳥嘌呤核苷酸交換因子家族的重要成員，也是FAK信號(hào)途徑的關(guān)鍵因子，能激活FAK通路下游Rho家族分子RhoA，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附與運(yùn)動(dòng)。張應(yīng)力可通過FAK/ERK途徑刺激Src家族激酶激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ARHGEF2的表達(dá)[14]。FAK途徑能誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞中MMP2的分泌。Wnt11是一種富含半胱氨酸的分泌性蛋白，是Wnt信號(hào)通路上重要的信號(hào)分子，與細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化密切相關(guān)。在效應(yīng)T細(xì)胞中，Wnt通路能誘導(dǎo)MMP2和MMP9的表達(dá)[7]。本研究結(jié)果顯示機(jī)械拉伸在誘導(dǎo)AQP1表達(dá)的同時(shí)能夠上調(diào)人角膜基質(zhì)細(xì)胞中ARHGEF2、Wnt11、MMP2基因的表達(dá)，表明作為屈光手術(shù)后繼發(fā)性圓錐角膜發(fā)生的影響因素之一，力刺激可以誘導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞中AQP1的表達(dá)，并激活下游FAK和Wnt信號(hào)通路，參與MMP2的表達(dá)調(diào)控，但力刺激誘導(dǎo)AQP1表達(dá)的作用機(jī)制還不清楚。

作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，Ca2+與cAMP在細(xì)胞正常生命活動(dòng)及生理功能的維持中發(fā)揮重要的作用。Ca2+參與了胞外力學(xué)信號(hào)到胞內(nèi)生物化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)換過程。機(jī)械拉伸能夠激活A(yù)T1R-Gq-PLC-DAG信號(hào)通路，進(jìn)而通過肌纖維膜TRPC3/6通道使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加[15]。單軸拉伸可以誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞中Ca2+與cAMP濃度的升高。研究表明，AQP1的表達(dá)受胞內(nèi)Ca2+及cAMP的調(diào)節(jié)。FOTIADIS et al研究發(fā)現(xiàn)AQP1的C端有與Ca2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[16]。Ca2+濃度變化能夠影響細(xì)胞中AQPs的透水性[17]。cAMP可通過PKA信號(hào)通路調(diào)節(jié)AQP1的表達(dá)，也可以通過激活蛋白激酶，促進(jìn)AQP1的磷酸化，提高AQP1的活性。本研究分析了機(jī)械拉伸對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞中Ca2+和cAMP濃度的影響，并進(jìn)一步探討了Ca2+在機(jī)械拉伸介導(dǎo)的AQP1及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)中的作用。結(jié)果顯示，機(jī)械拉伸能夠上調(diào)人角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+和cAMP的濃度。通過Ca2+螯合劑BAPTA降低胞內(nèi)游離Ca2+的濃度能夠抑制機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的cAMP、AQP1及其下游FAK、Wnt信號(hào)途徑相關(guān)的基因以及MMP2的表達(dá)。

研究結(jié)果顯示機(jī)械拉伸能夠通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度和cAMP濃度促進(jìn)AQP1的表達(dá)，并通過下游的FAK、Wnt信號(hào)通路在角膜細(xì)胞外基質(zhì)代謝過程中發(fā)揮作用。本研究可為進(jìn)一步揭示屈光手術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為圓錐角膜的臨床診斷和治療提供參考。